ПОЧВЕННЫЕ МИКРОБНЫЕ СООБЩЕСТВА КАК ИСТОЧНИК ШТАММОВ ДЛЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ СОИ ОТ ФУЗАРИОЗА В ПРИЕНИСЕЙСКОЙ СИБИРИ

ЭКОЛОГИЯ РАСТЕНИИ / PLANT ECOLOGY

УДК 579.64 https://doi.org/10.36906/2311-4444/20-2/01

С. А. Родовиков, А. А. Чураков, Н. М. Попова, С. В. Хижняк

почвенные микробные сообщества как источник штаммов для биологической защиты сои от фузариоза в приенисейской сибири

S. A. Rodovikov, A. A. Churakov, N. M. Popova, S. V. Khizhnyak

soil microbial communities as a source

of strains for the biological protection of soybeans against fusarium in the yenisei siberia

Аннотация. Из почвенных микробных сообществ Приени- Abstract. Eighteen strains of bacterial antagonists inhibitсейской Сибири выделены 18 штаммов бактерий-антагони- ing growth of Fusarium pathogens of soybean were isolatстов, подавляющих рост возбудителей фузариоза сои. Два ed from soil microbial communities of the Yenisei Siberia.

наиболее активных антагониста (штамм RSA-1, предвари- The two most active antagonists (RSA-1 strain, prelimiтельно идентифицированный как представитель р. Bacillus, и nary identified as Bacillus sp., and RSA-13 strain, prelimiштамм RSA-13, предварительно идентифицированный как nary identified as Streptomyces sp.) were tested as biologiпредставитель р. Streptomyces) были протестированы в каче- cal agents to protect soybeans from Fusarium infections in

стве биологических агентов для защиты сои от фузариоза в vitro. In the absence of artificial infection, the RSA-1 strain

лабораторных условиях. В отсутствие искусственного зара- reduced the Fusarium incidence by 25 percentage points

жения штамм RSA-1 снизил распространенность фузариоза на (from 61.5% to 36.5%, the statistical significance of the

значимость эффекта p < 0,001), штамм RSA-13 - на 32 про- Fusarium incidence by 32 percentage points (to 29.5%, the

центных пункта (до 29,5%, статистическая значимость эффек- statistical significance of the effect p <0.001). Artificial

та p < 0,001). Искусственное заражение сои фузариозом повы- infection of soybean with Fusarium increased the disease

сило распространенность заболевания до 83,5% и снизило incidence up to 83.5% and reduced the length of seedlings

рост проростков в 1,9 раза. При искусственном заражении by 1.9 times. In case of artificial infection with Fusarium,

фузариозом штамм RSA-1 статистически значимо (p < 0,001) the RSA-1 strain statistically significantly (p <0.001) reснизил распространенность заболевания на 29 процентных duced the incidence of the disease by 29 percentage points

пунктов и статистически значимо (p < 0,001) уменьшил инги- and statistically significantly (p <0.001) reduced the inhibiбирующее влияние инфекции на рост проростков. Штамм tory effect of the infection on seedling growth. Strain RSARSA-13 не повлиял на распространенность заболевания, одна- 13 did not affect the incidence of the disease, however,

ко статистически значимо (p < 0,001) снизил ингибирующее statistically significantly (p <0.001) reduced the inhibitory

влияние инфекции на рост проростков. effect of infection on the growth of seedlings.

Fusarium sp.; Приенисейская Сибирь; биологическая защита diseases; Fusarium sp.; Yenisei Siberia; biological control.

Сведения об авторах: Родовиков Сергей Александрович, ORCID: 0000-0002-4814-6493, Красноярский государственный аграрный университет, г. Красноярск, Россия, rsa12@mail.ru; Чураков Андрей Андреевич, ORCID: 0000-0002-3150-5541, канд. с.-х. наук, Красноярский государственный аграрный университет, г. Красноярск, Россия, andchurakov@gmail.com; Попова Наталья Михайловна, Красноярский государственный аграрный университет, г. Красноярск, Россия, nmpopova@yandex.ru; Хижняк Сергей Витальевич, ORCID: 0000-0003-2583-8857, д-р биол. наук, Красноярский государственный аграрный университет, г. Красноярск, Россия, skhizhnyak@yandex.ru.

About the authors: Rodovikov Sergey Aleksandrovich, ORCID: 0000-0002-4814-6493, Krasnoyarsk State Agrarian University, Krasnoyarsk, Russia, rsa12@mail.ru; Churakov Andrey Andreevich, ORCID: 0000-0002-3150-5541, Ph.D., Krasnoyarsk State Agrarian University, Krasnoyarsk, Russia, andchurakov@gmail.com; Popova Natalya Mikhailovna, Krasnoyarsk State Agrarian University, Krasnoyarsk, Russia, nmpopova@yandex.ru; Khizhnyak Sergey Vitalievich, ORCID: 0000-0003-2583-8857, Dr. habil., Krasnoyarsk State Agrarian University, Krasnoyarsk, Russia, skhizhnyak@yandex.ru.

В мировом сельском хозяйстве соя культурная (Glycine max (L.) Merr.) является самой распространенной белково-масличной культурой. Россия по производству соевых бобов занимает 9-е место в мире, а валовый сбор по стране с 1990 по 2018 гг. увеличился на 461% [13; 17; 20]. В последние годы рост посевных площадей под этой культурой наблюдается и в Сибири. Так, только за период 2016-2017 гг. в Новосибирской области рост посевных площадей под соей увеличился

более чем в 7 раз, в Красноярском крае - в 2,7 раза [9]. В 2018 и 2019 г. тенденция к росту площади посева сои сохранилась. Значительный ущерб посевам сои наносят фитопатогенные микроорганизмы, в первую очередь - возбудители грибных болезней [16; 20; 22]. По разным оценкам, потери урожая сои от болезней могут достигать 20-50% [1; 15; 20]. В условиях Дальневосточного региона и лесостепи Западной Сибири наиболее вредоносными фитопатогенами являются представители р. Fusarium, вызывающие корневые гнили и фузариозный вилт [2; 4]. По результатам наших исследований, среди возбудителей болезней сои в Красноярском крае также преобладают виды р. Fusarium, распространенность которых в ряде случаев достигает 100%. Разнообразие видового состава рода Fusarium затрудняет поиск источников устойчивости к этому фитопатогену [4; 5]. В этой связи наиболее эффективным способом защиты посевов сои от фузариоза и других грибных болезней является предпосевная обработка семян фунгицидами [15; 18]. Неуклонный рост химической нагрузки на агроценозы и способность вредных организмов вырабатывать резистентность к массово применяемым пестицидам актуализировали вопрос биологизации защиты растений сои от болезней путем замены химических препаратов на биопрепараты, создаваемые на основе микроорганизмов, проявляющих антагонизм в отношении возбудителей болезней [1; 3; 5; 8; 10; 21]. Мировая практика показывает, что высокая эффективность биопрепаратов может быть достигнута только при использовании в их составе штаммов, адаптированных к местным почвен-но-климатическим условиям [12; 14; 19; 23; 24]. В этой связи нами была проведена оценка перспектив защиты сои от грибных болезней в Приенисейской Сибири на основе бактерий, выделенных из автохтонных микробных сообществ.

Материалы и методы исследования Для выделения бактерий использовали образцы почвы из-под сои и пшеницы, отобранные в ООО «Учебно-опытное хозяйство "Миндерлинское"» (Красноярский край, Сухобузимский район). Выделение проводили методом рассева на агаризованную питательную среду №1 ГРМ производства ФБУН ГНЦ ПМБ (панкреатический гидролизат рыбной муки - 15,0 г/л, панкреатический гидролизат казеина - 10,0 г/л, дрожжевой экстракт - 2,0 г/л, натрия хлорид - 3,5 г/л, глюкоза -1,0 г/л, агар - 10,0 г/л), дополненной агаром до 20 г/л. Проверку антибиотической активности выделенных бактериальных изолятов в отношении грибов р. Fusarium проводили чашечным методом на питательной среде № 2 ГРМ (Сабуро) производства ФБУН ГНЦ ПМБ (панкреатический гидро-лизат рыбной муки - 10,0 г/л, панкреатический гидролизат казеина - 10,0 г/л, дрожжевой экстракт - 2,0 г/л, натрия фосфат однозамещенный - 2,0 г/л, глюкоза - 40,0 г/л, агар - 10,0 г/л), разведенной в 2 раза и дополненной агаром до 20 г/л. Предварительные исследования показали, что такая среда хорошо поддерживает как рост грибов р. Fusarium, так и рост выделенных изолятов почвенных бактерий. Выявление штаммов-антагонистов проводили по наличию зоны подавления роста тест-культуры вблизи бактериальных колоний. Дополнительную количественную проверку антагонизма проводили по подавлению прорастания конидий тест-культур в растворе 1%-ной глюкозы в присутствии бактерий-антагонистов [11] (рис. 1).

Рис. 1. Проверка антагонизма выделенных бактериальных изолятов в отношении Fusarium spp.: 1, 2, 3 - бактериальные изоляты, 4 - тест-культура Fusarium, 5 - нормальное прорастание конидии в отсутствии

бактерий-антагонистов после 24 часов инкубирования в 1%-ном растворе глюкозы, 6, 7 - ингибирование прорастания конидий в присутствии бактерий-антагонистов после 24 часов инкубирования

в 1%-ном растворе глюкозы (на примере штамма RSA-1)

Тест-культурами для проверки антибиотической активности бактериальных штаммов служили 4 морфологически различающихся изолята Fusarium sp., выделенные из пораженных фуза-риозом растений сои.

Микроскопические исследования и микрофотосъемку проводили с помощью микроскопа МИКМЕД-6 вариант 7, оснащенного фазово-контрастным устройством и цифровой камерой DCM-130E. Измерения бактериальных клеток проводили по микрофотографиям с помощью программы ImageJ, для пересчета пикселей в микрометры использовали объект-микрометр проходящего света ОМП ГОСТ 7513-55 производства ОАО «ЛОМО».

Лабораторную эффективность наиболее активных штаммов-антагонистов (RSA-1 и RSA-13) в подавлении развития фузариоза в сравнении с химическим протравителем проверяли методом рулонных культур на сое сорта Заряница (оригинаторы - ФГБНУ «Омский аграрный научный центр», ФГБОУ ВО «Красноярский ГАУ»; регион допуска - Восточно-Сибирский). В эксперименте использовали семена, полученные в ООО «Учебно-опытное хозяйство "Миндерлинское"» и характеризующиеся высоким (свыше 60%) уровнем естественной зараженности фузариозом. Схема эксперимента включала следующие варианты: контроль (семена без обработки); бактеризация штаммом RSA-1; бактеризация штаммом RSA-13; обработка химическим протравителем; искусственное заражение возбудителями фузариоза; искусственное заражение возбудителями фузариоза + бактеризация штаммом RSA-1; искусственное заражение возбудителями фузариоза + бактеризация штаммом RSA-13; искусственное заражение возбудителями фузариоза + обработка химическим протравителем. В каждом варианте было 4 повторности, по 50 семян в повторности. В качестве химического протравителя использовали препарат «Оплот» (действующие вещества: дифено-коназол - 90 г/л, тебуконазол - 45 г/л) производства АО Фирма «Август», обработку семян проводили в соответствии с инструкцией производителя.

Бактеризацию проводили водными суспензиями штаммов-антагонистов с титром 108 клеток на мл из расчёта 1 мл суспензии на 100 г семян, что соответствует стандартному расходу 10 л на тонну при обработке семян в полевых условиях. Искусственное заражение проводили суспензией конидий, полученной смывом с 10-суточных колоний 4 изолятов Fusarium sp., использованных для выявления штаммов-антагонистов, титр 106 конидий на мл. Учет распространенности фузариоза проводили в соответствии с Межгосударственным стандартом ГОСТ 12044-93 «Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения зараженности болезнями» [7]. Распространенность фузариоза вычисляли как выраженное в процентах отношение растений с признаками заболевания к общему числу растений. Кроме распространенности фузариоза учитывали длину надземной части проростков сои.

Математическую обработку результатов проводили с помощью Пакета анализа MS Excel 2007 и StatSoft STATISTICA 6.0. В качестве тестов при анализе распространенности заболевания использовали хи-квадрат (в случае множественного сравнения вариантов) и точный F-тест для таблиц 2^2 (в случае парного сравнения вариантов). В качестве тестов при сравнении длины проростков использовали двухфакторный дисперсионный анализ, где в качестве факторов выступали «наличие искусственного заражения» и «бактеризация», а при парном сравнении вариантов -двухвыборочный t-тест.

Результаты и их обсуждение

В ходе исследований было выделено 18 штаммов бактерий-антагонистов, проявляющих антибиотическую активность в отношении всех четырех изолятов р. Fusarium, выделенных из пораженных фузариозом проростков сои. Наибольшая антибиотическая активность отмечена у штаммов RSA-1 и RSA-13.

Штамм RSA-1 представлен грамположительными аэробными подвижными спорообразую-щими палочками. Спора - овальная, 1,5-2,4^0,7-1,3 мкм, расположение в клетке - центральное или субтерминальное. Прорастание споры - латеральное. Молодые клетки - до 24 мкм длиной, клетки в зрелой культуре - 4,2-9,6х 1,1-1,3 мкм (рис. 2). Штамм предварительно идентифицирован как представитель р. Bacillus.

Штамм RSA-13 представлен грамположительными аэробными актинобактериями. Подвижные стадии не выявлены. Споры - овальные, 1,4-1,8x0,9-1,2 мкм, формируются в закрученных спорангиях. Мицелий хорошо развитый, ветвящийся, толщина гиф варьирует от 0,8 до 1,7 мкм (рис. 3). Штамм предварительно идентифицирован как представитель р. Streptomyces.

В эксперименте с рулонными культурами в вариантах без искусственного заражения грибами р. Fusarium оба штамма статистически значимо (p < 0,001) снизили распространенность фузариоза с 61,5% в контроле до 36,5% (штамм RSA-1) и до 29,5% (штамм RSA-13).

Искусственное заражение статистически значимо (p < 0,001) повысило распространенность фузариоза во всех вариантах эксперимента (в среднем на 27,9 процентных пунктов). В варианте с бактеризацией штаммом RSA-1 распространенность фузариоза по-прежнему была статистически значимо (p < 0,001) ниже, чем в варианте без обработки (54,5% против 83,5%). В варианте с бактеризацией штаммом RSA-13 распространенность фузариоза (82,5%) не отличалась от варианта без обработки.

Наибольший эффект в снижении распространенности фузариоза как без искусственного заражения, так и при искусственном заражении семян оказал протравитель «Оплот» (распространенность фузариоза 22,0% и 40,5% соответственно) (рис. 4).

Рис. 2. Морфология штамма RSA-1: 1 - спора, 2 - набухшая спора, 3, 4 - прорастание споры, 5 - удлиненные клетки в молодой (17-часовой) культуре непосредственно после прорастания спор, 6 - клетки в зрелой (48-часовой) культуре, 7 - спорулирующие клетки

Рис. 3. Морфология штамма RSA-13: 1 - формирующийся спорангий, ■ споры, 3 - прорастание споры, 4 - мицелий

Без обработки

Оплот Без

обработки

RSA-13 Оплот

Без заражения

Заражение

Рис. 4. Распространенность фузариоза проростков сои в разных вариантах эксперимента

Однако «Оплот» оказал ярко выраженное и в высшей степени значимое (р < 0,001) угнетающее действие на рост проростков сои, как в отсутствие заражения (средняя длина проростков 3,60±0,17 см против 17,40±0,88 см в контроле), так на фоне искусственного заражения (средняя длина проростков 3,38±0,16 см против 9,32±0,97 см в варианте без обработки) (рис. 5, 6).

В то же время бактеризация обоими штаммами оказала стимулирующее влияние на рост проростков, особенно ярко проявившееся на фоне искусственного заражения. Так, в варианте с заражением средняя длина надземной части проростков при бактеризации штаммом RSA-1 соста2

вила 13,03±1,13 см, при бактеризации штаммом RSA-13 - 13,43±1,11 см, что в 1,4 раза превышает среднюю длину проростков в варианте без обработки.

При отсутствии искусственного заражения стимулирующий эффект бактеризации был не столь выражен - при бактеризации штаммом RSA-1 средняя длина проростков составила 17,74±0,88 см, при бактеризации штаммом RSA-13 - 19,15±0,91 см, что превышает среднюю длину проростков в варианте без обработки, соответственно, в 1,02 и 1,10 раза.

Дисперсионный анализ подтвердил угнетающее действие искусственного заражения грибами р. Fusarium на рост проростков (статистическая значимость p < 0,001), стимулирующее действие бактеризации на рост проростков (статистическая значимость p < 0,001), а также эффект взаимодействия факторов «заражение» и «бактеризация» (статистическая значимость p < 0,01). Значимость различий между вариантами по тесту Дункана представлена в таблице 1.

Можно предположить, что стимулирующий эффект бактеризации в значительной степени обусловлен подавлением развития фузариоза. Действительно, между распространенностью фуза-риоза и длиной проростков отмечена статистически значимая (p < 0,05) отрицательная корреляция (г = -0,823). Регрессионный анализ с использованием данных по отдельным повторностям показал, что снижение распространенности фузариоза на 1 процентный пункт увеличивает среднюю длину проростка на 0,2 см___

f -л* <j ,

кШнЫЯ

Рис. 5. Угнетающее действие протравителя «Оплот» на проростки сои на примере варианта без заражения: 1 - контроль, 2 - обработка «Оплотом»

Без обработки

Без заражения

Примечание: Бары на диаграммах означают 95%-е доверительные интервалы для среднего Рис. 6. Средняя длина надземной части проростков сои в разных вариантах

Таблица 1

Статистическая значимость (р) различий по длине проростков между вариантами эксперимента в рулонной культуре согласно тесту Дункана

Искусственное заражение Бактеризация Искусственное заражение

есть нет

RSA-1 RSA-13 нет RSA-1 RSA-13 нет

есть RSA-1 нет <0,001 <0,001 <0,001 <0,001

RSA-13 нет <0,001 <0,001 <0,001 <0,001

нет <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001

нет RSA-1 <0,001 <0,001 <0,001 <0,05 нет

RSA-13 <0,001 <0,001 <0,001 <0,05 <0,05

нет <0,001 <0,001 <0,001 нет <0,05

В целом можно констатировать, что выделенные штаммы-антагонисты в лабораторных испытаниях продемонстрировали сопоставимую с химическим протравителем эффективность в защите сои от фузариоза, и, в отличие от протравителя, не оказали негативного влияния на рост растений. Таким образом, нами продемонстрирована перспективность использования почвенных микробных сообществ Приенисейской Сибири для защиты сои от фузариоза.

Работа выполнена при финансовой поддержке научно-исследовательских работ, выполняемых высшими учебными заведениями, подведомственными Министерству сельского хозяйства России, финансовая поддержка - за счет средств федерального бюджета в 2020 г.

Литература

Plant Breeding Strategies: Legumes. Springer, Cham, 2019. P. 431-516. https://doi.org/10.1007/978-3-030-23400-3_12

REFERENCES

Родовиков С. А., Чураков А. А., Попова Н. М., Хижняк С. В. Почвенные микробные сообщества как источник штаммов для биологической защиты сои от фузариоза в Приенисейской Сибири // Вестник Нижневартовского государственного университета. 2020. № 2. С. 4-11. https://doi.org/10.36906/2311-4444/20-2/01

Rodovikov, S. A., Churakov, A. A., Popova N. M., Khizhnyak S. V. (2020). Soil microbial communities as a source of strains for the biological protection of soybeans against fusarium in the Yenisei Siberia. Bulletin of Nizhnevartovsk State University, (2). 4-11. (In Russian) https://doi.org/10.36906/2311-4444/20-2/01

дата поступления: 03 марта 2020 г. дата принятия: 25 апреля 2020 г.

© Родовиков С.А., Чураков А.А., Попова Н.М., Хижняк С.В.