Спросить
Войти
УДК 557.152.1+53
АМПЕРОМЕТРИЧНИЙ БІОСЕНСОР, МОДИФІКОВАНИЙ БАГАТОШАРОВИМИ ВУГЛЕЦЕВИМИ НАНОТРУБКАМИ, ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ ГЛЮКОЗИ
НАН України, Київ
E-mail: olga_beloivan@mail.ru
Отримано 14.11.2011
З метою поліпшення аналітичних характеристик амперометричних біосенсорів для визначення глюкози застосовано багатошарові вуглецеві нанотрубки. Атестовані зразки амінованих та карбо-ксильованих багатошарових вуглецевих нанотрубок суспендовано й використано для модифікації амперометричних біосенсорів на основі іммобілізованої глюкозооксидази та амперометричних перетворювачів С220АТ (Drop Sens, Іспанія). Біоселективну мембрану на основі глюкозооксидази формували на поверхнях робочих електродів кількома методами: ковалентним зшиванням і ко-іммобілізацією з пероксидазою хрону в гель бичачого сироваткового альбуміну в парах глутарового альдегіду та електрополімерізацією у плівку струмопровідного полімера поліетилендіокситіофену. Електрохімічні вимірювання виконували за допомогою приладу ^Stat 200 (Drop Sens, Іспанія). Встановлено, що біосенсори з біоселективною мембраною на основі багатошарових вуглецевих нанотрубок мають переваги над біосенсорами без вуглецевих нанотрубок в чутливості, можливості визначення глюкози за низького робочого потенціалу та ширшому діапазоні визначення концентрацій аналіту. Оптимізований біосенсор на основі мембрани з багатошаровими вуглецевими нанотрубками та глюкозооксидази використано для визначення глюкози у вині. Показано достовірну кореляцію результатів біосенсорного методу з методом високоефективної рідинної хроматографії.
Ключові слова: багатошарові вуглецеві нанотрубки, амперометричний біосенсор, глюкоза, глюкозооксидаза, нанокомпозитні мембрани.
Н. С. Рогальова1 Л. В. Шкотова1 О. В. Львова2 В. В. Гарбуз3 В. Б. Муратов3 Т. І. Дуда4 О. О. Васільєв4 Я. І. Корпан1 О. А. Білоіван1
Розроблення електрохімічних ензимо-сенсорів є важливим напрямом біотехноло-гії впродовж останніх десятиріч. На сьогодні вирішення проблем екологічного моніторингу довкілля, аналізу якості харчових продуктів, клінічної діагностики тощо ставить на порядок денний створення моно- та мультисенсорних пристроїв та аналітичних приладів на їх основі. Часто при розробленні біосенсорів виникає необхідність підвищення чутливості та селективності ензимних мембран, зниження мінімальної концентрації, що вимірюється біосенсором, можливості проводити аналізи в широкому діапазоні концентрацій та за низького робочого потенціалу. Головну роль у вирішенні цих завдань відіграє залучення наноматеріалів
та нанотехнологій. Останнім часом інтенсивно ведуться роботи зі створення високочутливих і селективних електрохімічних біосенсорів на основі вуглецевих нанотрубок (ВНТ) [1-7].
Як відомо, у більшості розроблених ампе-рометричних біосенсорів на основі іммобілізованих оксидоредуктаз використано принцип електрохімічної детекції пероксиду водню як продукту ензиматичного перетворення аналі-ту (субстрату). Біосенсори для визначення глюкози, зокрема на основі іммобілізованої глюкозооксидази (ГОД), не тільки мають важливе практичне застосування, але й завдяки тому, що ГОД є активною, високостабільною, добре вивченою і комерційно доступною окси-доредуктазою, набули широкого використання
як модель для впровадження нових технологічних рішень у біосенсориці.
Раніше нами було запропоновано метод іммобілізації глюкозооксидази за участю багатошарових вуглецевих нанотрубок, модифікованих аміногрупами [ВШВНТ(КИ2)], у протеїновий гель зшиванням глутаровим альдегідом (ГА) на поверхню золотих електродів [8]. З метою більш детального аналізу впливу БТТТВНТ у складі ензимних мембран на електрохімічні властивості біосенсорів у роботі проведено дослідження біосенсорів, створених із застосуванням декількох методів іммобілізації глюкозооксидази на електроди фірми Drop Sens (Іспанія), та здійснено аналіз глюкози у реальних зразках.
Матеріали і методи
У роботі використовували глюкозооксидазу (EC 1.1.3.4) з Aspergillus niger активністю 271 U/мг фірми Gengyme Corp. (Німеччина), D-глюкозу, пероксидазу хрону, тип VI (ПО) (ЕС 1.11.1.7) з активністю 263 U/мг, бичачий сироватковий альбумін (ВСА), 50%-й розчин глутарового альдегіду (ГА) виробництва Sigma-Aldrich Chemie (Німеччина), аміновані ВШВНТ(ЫН2) та карбоксильовані БШВНТ(СООН) фірми Drop Sens (Іспанія), полівінілпіролідон (ПВП) фірми Merck (Німеччина), мономер 3,4-етилендіокситіофен (ЕДТ) виробництва фірми Baytron M (ФРН), поліетиленгліколь 1450 (ПЕГ) фірми Sigma (Швейцарія), кар-бодіїмід, монойодоцтову кислоту, диметил-сульфоксид (ДМС), диметилформамід (ДМФА) та інші сполуки вітчизняного виробництва категорії «х. ч.» та «ч. д. а.».
Застосовували також триелектродні перетворювачі C220AT (далі — «золоті електроди»), виготовлені методом трафаретного друку, виробництва фірми Drop Sens (Іспанія), які описано раніше [8].
Для виготовлення лабораторних макетів біосенсорів чутливу мембрану формували на поверхні робочого електрода іммобілізацією ензиму. Для контрольних вимірювань застосовували датчики як без мембрани, так і з відповідними мембранами без ензиму.
Підготовка БШВНТ до роботи
Ідентифікацію складу зразків БШВНТ проводили за методом фракціонованого окиснення вуглецевих наноматеріалів (ВНМ), що є кулонометричним варіантом ступінчастої температурної карбоксиметрії [9]. Діапазон робочих температур становив
З метою встановлення типу функціонального покриву та ступеня функціоналі-зації матеріалів досліджували вміст газоут-ворювальних домішок методом імпульсної високотемпературної відновної екстракції вуглецем у потоці газу-носія гелію з наступним хроматографічним розділенням, ідентифікацією та вимірюванням кількості газів, що утворилися. Калібрування установки було виконано за допомогою державних стандартних зразків.
Суспендування БШВHT. Cуспендування зразків БШ^НГ проводили за допомогою ультразвукового сонікатора RK 102 H (Bandelin electronic, Німеччина). Аміновані БШBНT суспендували у водному розчині ПBП (100 мг/мл) протягом 30 хв за кімнатної температури. Tакий же час сонікації застосовували для виготовлення суспензій зразків БШBНT у ДMC чи ДMФА. Bодну суспензію карбоксильованих БШ^ОТ обробляли ультразвуком протягом 4 годин.
Електронна мікроскопія БШВHT. Фотографії TЕM отримали за допомогою трансмісійного електронного мікроскопа JEM-1230 (JEOL, Японія) колективного центру користування НАН України при Інституті ботаніки ім. M. Г. Холодного НАНУ.
Якість водних суспензій БШВHT(СООH) визначали за розміром наночастинок за допомогою приладу Nanosizer та за величиною Z-потенціалу на приладі Zetasizer Nano Z фірми Malvern Instuments (www.novations.com.ua).
Електрохімічні вимірювання
Вивчення вольтамперних характеристик електродів і вимірювання амперомет-ричного сигналу біосенсорів здійснювали за допомогою приладу ^Stat 200 (Drop Sens, Іспанія) з відповідним програмним забезпеченням, що був підключений до комп’ютера (http://www.dropsens.com/en/inicio.html).
Вимірювання проводили у відкритій комірці об’ємом 2,5 мл у 25 мМ фосфатному буфері, рН 7,0, за кімнатної температури та інтенсивного перемішування, як описано раніше [8]. За величину сигналу біосенсора, що відповідає певній концентрації субстрату, приймали середнє арифметичне з трьох паралельних вимірювань. Похибка вимірювань не перевищувала 7%.
Методи формування ензимоматриці на поверхні золотого електрода
Іммобілізація ГОД методом міжмолекулярного зшивання в протеїновий гель БСА у випарах ГА. Чутливу матрицю біосенсора формували нанесенням крапельним методом на поверхню робочого електрода 1,7 мкл відповідної вихідної суміші та подальшою іммобілізацією ковалентним зшиванням у протеїновий гель у насичених парах ГА [8]. Мембранна суміш містила 0,05-0,5% ГОД, 6% БСА, 2-6% суспензії БШВНТ(ЫН2) та 5% гліцеролу [далі — суміш ГОД-БСА-БШВНТ(ЫН2)]. Розчини протеїнів готували із застосуванням 25 мМ фосфатного буфера, рН 7,0. Електроди з нанесеною сумішшю інкубували в парах ГА протягом 40 хв за кімнатної температури. Після цього мембрани висушували на повітрі упродовж 30 хв та тричі відмивали 25 мМ фосфатним буфером (рН 7,0). Контрольну мембранну суміш готували за тією самою процедурою без додавання нанотрубок (далі — суміш ГОД-БСА).
Коіммобілізація ГОД та ПО у протеїнову мембрану в парах ГА (ГОД-ПО-БСА). Чутливу матрицю біосенсора формували аналогічно процедурі, що її описано вище. Мембранна суміш містила 0,05% ГОД, 1% ПО, 5% БСА та 5% гліцеролу.
Модифікація поверхні електрода БШВНТ(СООН). Поверхню робочого електрода обробляли протягом 30 хв спочатку 0,2 М водним розчином монойодоцтової кислоти, а потім 0,2 М водним розчином карбодіїміду. Після кожної обробки поверхню відмивали дистильованою водою. 2%-ну водну суспензію БШВНТ(СООН) крапельним способом наносили на поверхню електрода, витримували 30 хв і відмивали буфером. Модифіковані електроди застосовували для подальшої іммобілізації ензиму.
Включення ГОД до плівки електропровідного полімеру поліетилендіокситіофену (ГОД-ПЕДТ). Для електрохімічної полімеризації застосовували суміш, яка складалася
з 10 мM ЕД^ 1 мM ПЕГ та 0,048 мг/мл ГОД. Усі компоненти суміші готували у 20 мM фосфатному буфері, рН 6,2. На поверхню всіх електродів сенсора наносили 20 мкл такої суміші, підключали до потенціостату фірми DropSens і проводили 15 сеансів циклічної вольтамперометрії у діапазоні прикладених потенціалів +0,2 ... +1,5 B зі швидкістю 0,1 B/с [10, 11].
Результати та обговорення
Глюкозооксидаза є ФАД-вмісним ензимом, що забезпечує окиснення ß-D-глюкози до D-глюконолактону з утворенням пероксиду водню за схемою:
ГОД(ФАД) + Глюкоза + H2O ^
ГОД(ФАД^) + Глюконолактон; (1)
ГОД(ФАДЩ) + O2 ^ ГОД(ФАД) + H2O2; (2)
Н2О2 ^ 2Н+ + 2e-. (3)
Розроблення біосенсорів на основі БШBНT і ГОД передбачало вирішення таких питань: атестація електродів, визначення фазової чистоти та ступеня функціоналізації нанотрубок, суспендування нанотрубок і оцінювання якості суспензії, вибір методу іммобілізації нанотрубок і ГОД на поверхню електрода, визначення оптимальних умов функціонування і вивчення електрохімічних характеристик макетів біосенсорів.
У попередніх дослідженнях нами вивчено вольтамперні характеристики золотих електродів DropSens без ензимних мембран [8]. Показано, що додавання пероксиду водню змінює величину сигналу електроду за потенціалу 0,3-0,9 B, що свідчить про окис-нення Н2О2 на поверхні електрода, тимчасом як додавання глюкози практично не змінює форму кривої. Потенціал 0,8 B було обрано як оптимальний для проведення подальших амперометричних вимірювань. Bстановлено, що глюкоза не окиснюється/відновлюється на електроді за цього потенціалу [8].
Результати атестації фазового складу зразків нанотрубок, модифікованих різними функціональними групами: аміно[БШBНT(NH2)] та карбоксильними [БШ^Н^СООЩ], наведено відповідно на рис. 1, А і 1, Б. Як видно з рисунків, подані зразки — це високоякісний продукт, що містить лише нанотрубки як основну фазу. Інших фаз нановуглецю (наноцибулин, графітових нанопакетів, поперечно-шаруватих, конусно-шаруватих та сувоєподібних нановолокон) не виявлено.
Mодифікований аміногрупами зразок містить як основну фазу багатошарові
• — інтегральна залежність (% тс); X — диференціальна залежність (% Ашс)
Рис. 1. Температурна залежність окиснення зразків БШВНТ: А — БШВНТ^Н2); Б — БШВНТ(СООН)
нанотрубки (близько 91% мас.) з домішкою одношарових у кількості близько 4% мас. Зразок, модифікований карбоксильними групами, виявляє чітко виражений синглет окиснення, температура якого вказує на наявність однієї нановуглецевої фази — багатошарових нанотрубок.
У результаті дослідження типу функціонального покриву та ступеня функціоналі-зації зразків (див. розділ «Матеріали та методи») показано, що багатошарові нанотрубки, модифіковані аміногрупами, містили (% мас.): Н — 0,23; N — 0,3; О — 0,5. Залишок мінеральної складової після окиснення становив 3,6% мас. Згідно з результатами аналізу на газотвірні домішки, відповідно до розрахунку за можливими стехіометричними співвідношеннями, у зразку можуть бути присутні такі функціональні групи: аміно-, гідрокси-, ОН-. Цей висновок потребує уточнення, наприклад методом ІЧ-спектро-скопії.
Аналогічно зразок, модифікований карбоксильними групами, містить (% мас.): Н —
Tаким чином, дослідження фазового складу зразків нанотрубок показало, що застосовані препарати є високоякісними продуктами, які містять як основну фазу багатошарові нанотрубки. Атестовані зразки нанотрубок було випробувано для отримання суспензій для подальшої модифікації як поверхні золотих робочих електродів перед іммобілізацією ензимної мембрани, так і чутливих мембран біосенсорів (див. розділ «Матеріали і методи»).
Оскільки БШВНТ(ЫН2) не «розчиняються» у воді, для визначення способу їх суспендування було випробувано ультразвукову обробку сумішей амінованих БШВНТ у полярних розчинниках ДМС, ДМФА та водорозчинному полімері ПВП, як описано в розділі «Матеріали і методи». У разі застосування ДМС зміну стану нанотрубок не спостерігали, а використання ДМФА призводило до часткового збільшення об’єму БШВНТ(ЫН2). У випадку ПВП отримували стабільну суспензію нанотрубок. Окрім того, ушкоджувальна дія ПВП, що використовується як замінник крові та входить до складу ліків і косметичних засобів, є меншою для ензиму [12], а це важливо за умов включення суспензії до складу ензимної мембрани. Оптимальним часом для оброблення ультразвуком визначено 30 хв. Загальний вигляд суспензії, а також розподіл БШВНТ-ЫН2 у полімері подано на рис. 2.
Отриману суспензію було використано для модифікації мембранної суміші ГОД-БСА
Рис. 2. Фотографії суспензії БШВНТ(КИ2) у ПВП:
А — загальний вигляд суспензії через місяць після утворення;
Б — розподіл БШВНТ(МИ2) у полімері ПВП (фото зроблено за допомогою трансмісійного електронного мікроскопа ^М-1230 фірми JEOL, Японія)
БШЕНГ, %
ГОД, %
Рис. 3. Oптимізація складу мембрани біосенсора на основі мембрани ГОД-БСА-БШВНТ^Н2):
А — залежність величини відгуку біосенсора (0,5% ГОД) на внесення глюкози (крива 1 — 1 hM, крива 2 — 3 mM) від концентрації нанотрубок у мембрані;
Б — залежність величини відгуку біосенсора [2% БШЕНЦМЕ^)] на внесення глюкози (3 mM) від концентрації ГОД у мембрані. Бимірювання проводили у 25 mM фосфатному буфері, рН 7,0, за кімнатної температури та поданого потенціалу 0,8 B
і подальшої іммобілізації у випарах ГА на поверхні золотого електрода з метою створення біоматриці як системи зв’язаних елементів ГОД-БCА-БШBНT(NH2), в якій відбувається полегшене перенесення електронів, як описано раніше [8]. Показано, що концентрація БШБНT у мембрані 1-2% є оптимальною (рис. 3, А). Підвищення концентрації БШBНT вище 2% сприяло збільшенню величини амперометричного сигналу, але водночас значно зростали «шуми», що негативно впливало на точність результатів і підвищувало рівень мінімальної концентрації глюкози, яка може бути виміряна (табл. 1). Збільшення концентрації ГОД вище 0,3% неістотно впливає на величину сигналу біосенсора (рис. 3, Б).
На рис. 4 (А, крива 6) показано калібрувальну криву біосенсора на основі розробленої мембрани. У додатковому експерименті ми використовували як контроль карбо-ксильовані нанотрубки (Б, крива 2) і показали, що «зшивання» протеїну та амінованих нанотрубок за допомогою ГА (Б, крива 1) сприяє поліпшенню чутливості біосенсора (рис. 4, Б).
З метою полегшити перенесення електронів у мембрані біосенсорів традиційно застосовують електропровідні полімери як матрицю для включення ензиму [13] або додають медіатори, функцію яких може виконувати пероксидаза хрону [14]. Нами проведено порівняння характеристик біосенсо-рів, створених на основі золотих електродів
Глюкоза, mM
Глюкоза, mM
Рис. 4. А — калібрувальні криві біосенсорів для визначення концентрації глюкози, створених на основі золотих електродів, та ГОД, іммобілізованої різними методами:
Б — калібрувальні криві біосенсорів, створених на основі мембран:
та ГОД, іммобілізованої різними методами (див. розділ «Матеріали і методи») (рис.
Водночас основні очікування від застосування нанотрубок пов’язані з можливістю ефективної роботи біосенсора за різних робочих потенціалів. Багато речовин у біологічних рідинах можуть легко окиснюватись чи відновлюватись за значень потенціалу, близьких до 0,8 В. Зниження потенціалу вимірювання аналіту може запобігати впливу інтерферуючих речовин та підвищувати точність аналізів.
Перевірено можливість визначення глюкози розробленими біосенсорами за низького
потенціалу. Показано, що включення БШВНТ до біосенсорної матриці ГОД є найбільш ефективним щодо зниження робочого потенціалу вимірювань (табл. 2).
Низку експериментів проведено з метою з’ясування впливу модифікації поверхні робочого електроду шаром нанотрубок (див. розділ «Матеріали і методи») на величину сигналу біосенсора.
На рис. 5 наведено калібрувальні криві біосенсорів з мембраною БСА-ГОД на основі золотих електродів (крива 3) та золотих електродів, модифікованих шаром БШВНТ (крива 4). Порівняння калібрувальних кривих показало, що шар нанотрубок, створений на електроді, не впливав на підвищення чутливості вимірювань, однак сприяв розширенню лінійного діапазону визначення концентрації глюкози у пробі, що свідчить про підвищення ефективної площі поверхні самого електрода. Водночас включення БШВНТ у склад ензимної мембрани підвищує величину сигналу біосенсора (криві 5, 6), імовірно за рахунок збільшення ефективної площі поверхні іммобілізованого ензиму.
Табл. 1. Загальні характеристики розроблених біосенсорів на основі БШВНТ(КИ2)
Склад біоселективної мембрани Чутли- вість, цА/мМ Мінімальна концентрація для визначення, мМ Лінійний діапазон, мМ Збереження активності під час зберігання, % Збереження активності протягом 5 год безперервної роботи, % Похиб- ка вимі- рю- вань^ Час стабілізації базової лінії, с Час відгуку, с
ГОД (0,05%) ВСА 4,8 0,05 0,05-3,00 90% після 35 діб 100 5 400 60
ГОД (0,05%) ВШВНТ(га2) (2%) ВСА 6,6 0,05 0,05-6,00 88% після 35 діб 100 8 800 80
ГОД (0,05%) ВШВНТ^Н2) (6%) ВСА 7,0 0,50 0,5-8,0 - 100 10 1 5002 000 100
Примітка. Вимірювання проводили за значення потенціалу 0,8 В.
Табл. 2. Порівняння аналітичних характеристик амперометричних біосенсорів для визначення глюкози на основі золотих електродів Drop Sens та іммобілізованої ГОД
Потенціал, В Електрополімеризація ГОД ГОД-БСА ГОД-ПО-БСА ГОД-БСА-БШВНТ
цА/мМ Лінійний діапазон, мМ цА/мМ Лінійний діапазон, мМ цА/мМ Лінійний діапазон, мМ цА/мМ Лінійний діапазон, мМ
Глюкоза, мМ
Рис. 5. Залежність величини амперометричного сигналу глюкозних біосенсорів, модифікованих БШВНТ, різного дизайну:
ГОД-БСА без нанотрубок;
БШВНТ(СООН) з мембраною ГОД-БСА;
ГОД-БСА-БТТТВНТ^Н2);
БТПВНт(сООН), з мембраною ГОД-БСА-БШВНт&(КН2).
Вимірювання проводили у 25 мМ фосфатному буфері (рН 7,0) за поданого потенціалу 0,8 В, при кімнатній температурі
Розроблений біосенсор з матрицею Г0Д-БСА-БШВНТ(КН2) було випробувано для визначення концентрації глюкози в зразках мікробіологічного середовища MEM Dul-becco, виробництва фірми Serva (Німеччина), у сироватці та плазмі крові, цільній крові й зразках марочного вина порівняно з традиційними методами. Оптимальні умови для роботи біосенсора (25 мМ фосфатний буфер, рН 7,0) було визначено раніше [8]. З’ясовано, що для проведення вимірювань у зразках мікробіологічного середовища, сироватці
і плазмі крові та цільній крові потрібно застосовувати додаткові захисні мембрани, що є завданням нашої подальшої роботи.
Проведено аналізи вмісту глюкози в зразках вина різних сортів з використанням амперометричного біосенсора з матрицею ГОД-БСА-БШВНТ(КН2). Результати вимірювань — порівняно з даними, отриманими за методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) в умовах виробництва в Інституті винограду та вина «Магарач». Показана достовірна кореляція результатів (рис. 6).
Зразки вина
Рис. 6. Результати вимірювання глюкози
у зразках марочного вина біосенсорним та хроматографічним методами (надані виробником):
Tаким чином, комерційні зразки амінова-них [(БШ^^^^)] та карбоксильованих [БШBНT(CООН)] багатошарових нанотрубок досліджено відносно фазового складу вуглецевого наноматеріалу, типу функціональних груп на їхній поверхні та ступеня їх функ-ціоналізації. Показано, що проаналізовані препарати є високоякісними продуктами, які містять як основну фазу багатошарові нанотрубки. Підібрано умови суспендування БШБН^МИ^) у ПБП та БШБН^ШОН) у воді. Розроблені суспензії застосовано для модифікації поверхні золотих амперометрич-них електродів та іммобілізації ензиму. На основі триелектродних амперометричних перетворювачів C220АT (Drop Sens) створено та досліджено лабораторні макети біосенсорів для визначення глюкози із застосуванням кількох стратегій іммобілізації ГОД (ковалентне зшивання ГОД з БШБН^КИ^) у гель БCА, електрополімерізація ГОД у матрицю електропровідного полімера, коіммобілізація ГОД з пероксидазою хрону). Бстановлено, що БШBНT у складі біосенсорів поліпшують аналітичні характеристики біосенсорів вірогідно за рахунок виконання ними електропровідної та медіаторної функції, а також збільшення ефективної площі поверхні електродів. Оптимізований біосенсор на основі мембрани з БШБН^КИ^) та ГОД застосовано для визначення глюкози у вині. Показано добру кореляцію біосенсорного методу з методом високоефективної рідинної хроматографії.
Роботу виконано за фінансової підтримки ДЦHT « H ано технології та нанома-теріали» у рамках проекту № Б.20.І.І3.
Загальний вигляд триелектродного амперометричного датчика С220АТ («Бгорвепв», Іспанія) (А) та експериментальної установки, зібраної на базі приладу Ціаі 200 («Ьгорвепв», Іспанія) (Б)
ЛІТЕРАТУРА
AМПЕРOМЕТРИЧЕCКИЙ БИOCЕНCOР, МOДИФИЦИГОBAННЬШ МНOГOCГЕНOЧНЫМИ УГЛЕРOДНЫМИ НAНOТРУБКAМИ, ДЛЯ OПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮ^ЗЫ
H. С. Рогалева1, Л. В. Шкотова1, О. В. Львова2, В. В. Гарбуз3, В. Б. Муратов3, T. И. Дуда4,
А. А. Васильев4, Я. И. Корпан1, О. А. Белоиван1
И. Н. Францевича НАН Украины, Киев
E-mail: olga_beloivan@mail.ru
C целью улучшения аналитических характеристик амперометрических биосенсоров для определения глюкозы использованы многостеноч-ные углеродные нанотрубки. Аттестованные образцы аминированных и карбоксилирован-ных многостеночных углеродных нанотрубок суспендированы и использованы для модификации амперометрических биосенсоров на основе иммобилизованной глюкозооксидазы и амперометрических преобразователей C220АT (Drop Sens, Испания). Биоселективную мембрану на основе глюкозооксидазы формировали на поверхности рабочих электродов несколькими методами: ковалентным связыванием и коиммоби-лизаций с пероксидазой хрена в гель бычьего сывороточного альбумина в парах глутарового альдегида, электрополимеризацией в пленку токопроводящего полимера полиэтилендиокситио-фена. Электрохимические измерения выполняли при помощи прибора ^Stat 200 (Drop Sens, Испания). Установлено, что биосенсоры с биосе-лективной мембраной на основе многостеноч-ных углеродных нанотрубок, имеют преимущества по сравнению с биосенсорами без углеродных нанотрубок в чувствительности, возможности определения глюкозы при низком рабочем потенциале и в более широком диапазоне определения концентраций аналита. Оптимизированный биосенсор на основе мембраны с многостеночными углеродными нанотрубками и глюкозооксидазы использован для определения концентрации глюкозы в вине. Показана достоверная корреляция результатов биосенсор-ного метода с методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
AMPEROMETRIC BIOSENSOR MODIFIED WITH MULTIWALLED CARBON NANOTUBES FOR GLUCOSE DETERMINATION
N. S. Rogaleva1, L. V. Shkotova1, O. V. L’vova2,
V. V. Garbuz3, V. B. Muratov3, T. I. Duda4,
O. O. Vasil’ev4, Ya. I. Korpan1, O. A. Biloivan1
institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: olga_beloivan@mail.ru
To improve analytical characteristics of amperometric biosensors for glucose determination, aminated and carboxylated multiwalled carbon nanotubes were applied. Attested samples of nanotubes were suspended and used for modification of amperometric transducers C220AT of DropSens production and bio-selective membranes. The glucose oxidase membranes were formed on the surface of working electrode by several methods: covalent crosslinking and coimmobilization with horseradish peroxidase in bovine serum albumin gel in glutaraldehyde vapors; electropolymerization of poly(3,4-ethyl-enedioxythiophene) in the conductive polymer film. Electrochemical measurements were performed using the device pStat 200 of DropSens production. The developed amperometric biosensors with a membrane with carbon nanotubes have been shown to be advantageous as compared to those without carbon nanotubes in terms of higher sensitivity, lower working potential, and wider dynamic range of the target analyte detection. The optimized biosensor was used for detection of glucose in real wine samples. A reliable correlation was observed between the results of biosensor method proposed and those obtained by high performance liquid chromatography.
