Спросить
Войти
УДК 577.152.321+663.11
КУЛЬТИВУВАННЯ БАЗИДІОМІЦЕТІВ — АКТИВНИХ ПРОДУЦЕНТІВ ЦЕЛЮЛОЗОЛІТИЧНИХ
ЕНЗИМІВ
І. Загальна целюлозолітична активність культуральних фільтратів базидіоміцетів
К. Г. Древаль Донецький національний університет
М. І. Бойко
E-mail: k.dreval@gmail.com
Отримано 06.06.2011
Підібрано умови культивування базидіоміцетів — активних продуцентів целюлозолітичних ензимів за факторами рН живильного середовища (значення рН варіювали від 3 до 9 з інтервалом 1 од) і температури (значення змінювались від 24 до 36 °С з інтервалом 2 °С). Визначали загальну целюло-золітичну активність усіх ензимів комплексу целюлаз відносно фільтрувального паперу. Встановлено, що оптимальне початкове рН живильного середовища для всіх штамів дорівнює 7, температура культивування — 28 °С для штаму Sh-1 Stereum hirsutum, 32 °С — для штаму AnSc-1 Daedaleopsis confragosa f. confragosa та 34 °С — для штамів К-1, А-Дон-02, Д-1 Irpex lacteus. У результаті оп-тимізації умов культивування значення загальної целюлозолітичної активності зросли на 16% для штаму К-1 Irpex lacteus, на 19% — для А-Дон-02 Irpex lacteus, на 107% — для Sh-1 Stereum hirsutum і на 159% — для Д-1 Irpex lacteus. Водночас підбір умов культивування дав змогу підвищити питому загальну целюлозолітичну активності штаму Sh-1 S. hirsutum на 9%, штаму А-Дон-02 I. lacteus — на 23%, штаму AnSc-1 D. confragosa f. confragosa — на 51%, штаму Д-1 I. lacteus — на 143%. Для штаму J-2An Phellinus pomaceus активності целюлаз у жодному варіанті досліду не виявлено. Максимальну загальну активність ензимів целюлозолітичного комплексу для культур К-1, А-Дон-02, Д-1 Irpex lacteus та AnSc-1 D. confragosa f. confragosa встановлено на 7-му добу експерименту, тим-часом як для культури Sh-1 S. hirsutum — на 14-ту добу.
Ключові слова: базидіоміцети, целюлозолітичні ензими, температура культивування,
рН середовища, оптимізація, Irpex lacteus, Stereum hirsutum, Daedaleopsis confragosa f. confragosa, Phellinus pomaceus.
У сучасних умовах недостатнього забезпечення України власними паливно-енергетичними ресурсами деревина постає одним із найбільш доступних та перспективних джерел відновлюваної енергії [1, 2]. Водночас біотехнологічна галузь виробництва біопалива відчуває нестачу високопродуктивних штамів грибів, здатних до синтезу ензимів, що гідролізують целюлозу [3, 4]. У процесі попереднього скринінгу активних продуцентів целюлозолітичних ензимів визначено штами вищих базидіальних грибів, що можуть бути перспективними об’єктами біотехнологічного застосування целюлаз [5]. Загальновідомо, що стадія ферментації є основним етапом у біотехнологічному процесі, оскільки під час її перебігу відбувається взаємодія продуцента із субстратом та утворення цільових продуктів [6]. Саме тому умови цієї стадії є одним з основних критеріїв успішності всього процесу. Серед чинників, що найбільшою мірою впливають на організм-продуцент під час ферментації, головну роль відіграють хімічні та фізичні, зокрема рН живильного середовища та температура культивування, відповідно [7-9]. Тому одним із шляхів підвищення біосинте-тичної здатності продуцента без зміни його генетичного апарату є визначення оптимальних значень хімічних і фізичних чинників культивування, що впливають на його ензиматичну активність. Підібравши їх оптимальні значення, можна підвищити синтез цільового продукту продуцентами у кілька разів [6].
Метою роботи було визначення оптимальних значень температури та рН живильного середовища для культивування базидіоміцетів — активних продуцентів целюлозолітичних ензимів.
Матеріали і методи
Об’єктами досліджень були 6 штамів вищих базидіальних грибів, що їх на попередньому етапі скринінгу [5] відібрали як активні продуценти целюлозолітичних ензимів: К-1, A-Дон-02 та Д-1 Irpex lacteus (Fr.) Fr.; Sh-1 Stereum hirsutum (Willd.) Pers.; AnSc-1 Daedaleopsis confragosa f. confragosa (Bolton) J. Schrot. та J-2An Phellinus pomaceus (Pers.) Maire.
Для дослідження целюлозолітичної активності штами культивували на рідкому середовищі Чапека такого складу (г/л): NaNO3 — 2, K2HPO4 — 1, MgSO4?H2O — 0,5, KCl — 0,5, FeSO4?H2O — 0,01 [10]. Початкове рН живильного середовища доводили до значень від 3 до 9 з кроком 1 рН за допомогою 10%-х розчинів HCl або NaOH на аналізаторі іонів AI-123 (Україна). Культивування проводили протягом 14 діб за температури від 24 до 36 “С з інтервалом 2 “С в термостатах ТС-80 та ТС-80-М2 (Росія). Як єдине джерело вуглецю до середовища додавали фільтрувальний папір Whatman №1 у кількості 8 г/л. Загальну активність ензимів целюлозолі-тичного комплексу (ФПA — FPA — filter paper activity) культуральних фільтратів (КФ) базидіоміцетів визначали відносно фільтрувального паперу Whatman №1, щільність 80 г/м2. Склад реакційних сумішей при визначенні ензиматичної активності та умови проведення реакцій відповідали рекомендаціям IUPAC [11] та загальноприйнятим методикам [12, 13]. Обчислюючи результати, за одиницю активності (IU) приймали таку кількість ензиму, яка утворювала
Усі дослідження проводили у трикратній повторності. Статистичну обробку здійснювали методами дисперсійного аналізу, порівняння середніх — методом Дункана [16]. За обраного нами типу графічних зображень програма Excel не дозволяє встановити похибки даних. Однак, статистичну обробку даних проводили, достовірність/недостовір-ність усіх даних визначали методами дво-факторного дисперсійного аналізу, а порівняння середніх здійснювали за Дунканом (рівень значущості = 0,05).
Результати та обговорення
Результати дослідження загальної ФПА культуральних фільтратів базидіоміцетів залежно від температури культивування та значення початкового рН живильного середовища на 7-му та 14-ту добу експерименту подано на рис. 1 і рис. 2 відповідно. З рис. 1, а видно, що загальна ФПА КФ штаму К-1 I. має кілька максимумів. Абсолютний
максимум ФПА для цього штаму визначено при культивуванні за температури 34 °С та початковому рН 7 живильного середовища. Встановлене за цих умов значення ФПА КФ штаму К-1 I. Ш^єш достовірно вище на 16% від того, що було зафіксовано на попередньому етапі дослідження. Це свідчить про інтенсифікацію синтезу позаклітинних це-люлозолітичних ензимів штамом К-1 I. teus за цих умов. На 14-ту добу культивування загальна ФПА КФ цього штаму (рис. 2, а) мала один достовірний максимум, який зсувався в зону меншого значення початкової кислотності живильного середовища (рН 5) та меншої температури культивування ^ = 32 °С) порівняно з максимумом ФПА КФ цього штаму на 7-му добу експерименту. Загалом, значення ФПА КФ штаму К-1 I. teus, визначені на 7-му добу культивування, були вищі, ніж на 14-ту добу, що свідчить про швидку адаптацію продуцента до нових умов зростання, яка виявляється в індукції синтезу целюлозолітичних ензимів. Якщо брати до уваги значення ФПА, більші за 2 ГО/шІ, то можна побачити, що на 7-му добу культивування целюлозолітична активність цього штаму вища за низьких і високих температур та дещо знижувалась у діапазоні середніх температур експерименту. ФПА майже відсутня за всіх температур культивування при початковому рН живильного середовища на рівні 3 та 9 одиниць, що можна пояснити екстремальними значеннями рН, за яких штам втрачав здатність до росту, а отже, і синтезу целюлозолітичних ензимів.
Для загальної целюлозолітичної активності КФ штаму А-Дон-02 I. Ш^єш як на 7-му (рис. 1, б), так і на 14-ту (рис. 2, б) добу культивування характерним є те, що максимуми активності зсунуто в діапазон відносно високих значень початкової кислотності живильного середовища (рН 5-8) та високих температур зростання (28-34 °С на 7-му добу експерименту та 28-36 °С — на 14-ту). На 7-му добу культивування ФПА штаму А-Дон-02 I. ^^єш має один достовірний максимум активності, визначений за температури 34 °С та рН 7, який достовірно перевищує значення ФПА, зафіксоване в процесі скринінгу, на
Під час культивування штаму Д-1 I. Іас-teus під дією різних градацій хімічних і фізичних чинників на 7-му добу експерименту (рис.
Для культури 8Ь-1 5. Ні^иШш є характерною особливість, що відрізняє її від усіх інших досліджуваних культур — максимум ФПА визначено на 14-ту добу культивування. Це вказує на те, що ця культура довше за
інші пристосовувалась до нових умов культивування. На 7-му добу культивування цей штам виявляв незначну ФПА (рис. 1, г), а на 14-ту добу встановлено 2 піки активності, які достовірно відрізнялись один від одного (рис. 2, г). Абсолютний максимум ФПА зафіксовано при культивуванні на живильному середовищі з рН 7 та за температури 28 °С. Оптимізоване значення ФПА перевищує величину, встановлену під час вирощування за неоптимізованих умов, на 107%. На 14-ту добу культивування штам 8Ь-1
Для культури Аи8е-1 Б. confragosa £. confragosa характерними є 3 чітких піки ФПА на 7-му добу культивування, які достовірно не відрізняються між собою (рис. 1, д) та майже повна відсутність ФПА на 14-ту добу проведення експерименту (рис. 2, д). На 7-му добу культивування мінімальна ФПА цього штаму спостерігається за умов культивування при температурі 26, 30, 34 та 36 °С та рН 6,8 і 9 живильного середовища.
Досліджуючи ФПА культури J-2An P.poшaceus за умов дії різних хімічних і фізичних чинників (хімічних — це різні градації рН живильного середовища, а фізичні — різні температури культивування) не виявили здатності до гідролізу фільтрувального паперу в усіх варіантах досліду (рис. 1, е та 2, е). Зважаючи на те, що в умовах експерименту з дослідження впливу фізико-хімічних чинників в усіх варіантах досліду в КФ цього штаму не фіксували достовірної різниці за вмістом редукуючих цукрів та протеїнів порівняно з контролем (як на 7-му, так і на 14-ту добу), нормальний ріст штаму в культурі на картопляно-глюкозному середовищі, на середовищі Чапека з додаванням глюкози як джерела вуглецю (8 г/л) та накопичення в КФ екзогенних протеїнів у цьому разі, наявність ФПА у штаму J-2An P.poшaceus на попередньому етапі досліджень можна розглядати як артефакт, адже дані не відтворено при повторному проведенні експерименту.
Паралельно з дослідженням ФПА розраховували питому ФПА (ПФПА). Результати розрахунків на 7-му і 14-ту добу культивування наведено на рис. 3 та 4 відповідно. Розраховані значення ПФПА були вищими за встановлені значення ФПА, що може бути відображенням змін у накопиченні протеїнів у КФ за експериментальних умов культивування. Залежність ПФПА від хімічних і фізичних умов культивування відмінна від залежності ФПА, що вказує на варіювання рівня накопичення протеїнів у КФ базидіоміцетів за умов дії різних фізико-хімічних чинників.
ПФПА штаму К-1 I. lacteus вирізнялась тим, що мала два максимуми — на 7-му та 14-ту добу культивування, достовірної різниці між якими не виявлено (рис. 3, а та
На 7-му добу культивування штаму А-Дон-02 I. Іа^еш ПФПА не мала чіткого максимуму (рис. 3, б), значення, отримані на живильному середовищі з рН 6 за температури 32 °С, достовірно не відрізнялись від показника, визначеного при культивуванні на середовищі з рН 7 за температури 34 °С. На 14-ту добу культивування чітко виявляються зони з мінімальною ПФПА
рн. од
■ 3,0-10,0 ■ 8,0-10,0
□ б,0-3,0 □ Є,0-8,0
□ 2,0-4,0 о 2.0-4.0
□ 0,0-2,0 10.0 // □ 0,0-2,0
рн.ед
^ = 26-28 °С при рН від 5 до 9 та за умов культивування при рН від 3 до 5 за t = 28-36 °С), що відображено на рис. 4, б. У разі вирощування штаму А-Дон-02 I. Іа^еш в оп-тимізованих умовах культивування значення ПФПА на 23% вище, ніж у неоптимізова-них умовах.
ПФПА штаму Д-1 I. Іа^еш мала один достовірний максимум, зафіксований на 7-му добу (рис. 3, в). Значення ПФПА при культивуванні за оптимізованих умов на 143% перевищували ПФПА, визначене за неоп-тимізованих умов. Так само, як ФПА штаму Д-1 I. Іасіеш за умов вирощування під дією різних фізико-хімічних чинників — сукупна дія різних градацій рН живильного середовища (хімічних) та температури культивування (фізичних) — ПФПА на 14-ту добу культивування не має значних піків активності (рис. 4, в).
ПФПА штаму 8Ь-1 5. Ні^иШш поступово зростала із 7-ї на 14-ту добу культивування. На відміну від значень, встановлених на 7-му добу експерименту з одним чітким піком активності (рис. 3, г), на 14-ту добу культивування чітко виділялись 2 піки питомої активності, які достовірно між собою не відрізнялись (рис. 4, г). При цьому значення ПФПА штаму 8Ь-1 5. Ні^иШш в разі культивування в оптимізованих умовах перевищували ПФПА за неоптимізованих умов на 9%.
Для значень ПФПА штаму Ап8с-1 характерна аналогічна динаміка до значень ФПА, встановлених за культивування в умовах дії хімічних і фізичних чинників різної інтенсивності. На 7-му добу культивування виявлено один чіткий максимум активності (рис. 3, д), який перевищував значення ПФПА, встановлене за умов вирощування в неоптимізованих умовах культивування, на
■ 8,0-10,0
□ 6,0-8,0
□ 4,0-6,0
■ 2,0-4,0
□ 0,0-2,0
pH- вд
pH. £Щ
З рис. 3, е та 4, е видно, що ПФПЛ штаму J-2An P. pomaceus не виявлено за умов культивування при різних значеннях рН живильного середовища та температури вирощування.
Отже, в результаті проведеної роботи оп-тимізовано умови культивування базидіоміцетів — активних продуцентів целюлозолі-тичних ензимів з метою підвищення їхньої здатності до гідролізу фільтрувального паперу. В результаті оптимізації умов культивування значення загальної целлюлозолітичної активності зросли на 16-159%, а питомої — на 9-143% у різних штамів грибів. Встановлено, що для всіх штамів максимальна ФПЛ проявляється за культивування на живильному середовищі з рН Т. При цьому слід було очікувати зростання активності ензимів в умовах вирощування грибів на живильних середовищах з рН вище Т, за яких відбувається частковий гідроліз фільтрувального паперу, що слугує джерелом вуглецю у процесі культивування, однак за лужних умов спостерігалось пригнічення росту базидіоміцетів. Загальною тенденцією для всіх культур було й те, що за високих температур культивування
ЛІТЕРАТУРА
Т. Ферментные системы высших базидиоми-цетов / Под ред. Даниляк Н. И., Семичаевс-кий В. Д., Дудченко Л. Г. и др. — К.: Наук. думка, 1989. — 280 с.
обмежувальним чинником росту та синтезу целюлозолітичних ензимів стає саме температура, оскільки при різних значеннях початкового рН живильного середовища активність ензимів відносно фільтрувального паперу була однаковою (крім культури А-Дон-02 I. Іас-teus на 14-ту добу культивування).
Таким чином, для досягнення більшого виходу в середовище целюлозолітичних ензимів базидіоміцети слід культивувати за таких умов: штами К-1, А-Дон-02 та Д-1 I. Іас-teus — за температури 34 °С, рН 7; штам вЬ-1
Роботу проведено за спонсорської підтримки громадської організації «Развитие» (Росія).
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БАЗИДИОМИЦЕТОВ — АКТИВНЫХ ПРОДУЦЕНТОВ ЦЕЛЛЮЛОЗОЛИТИЧЕСКИХ ЭНЗИМОВ
I. Общая целлюлозолитическая активность культуральных фильтратов базидиомицетов
К. Г. Древаль М. И. Бойко
Донецкий национальный университет
E-ma.il: k.dreval@gmail.com
Подобраны условия культивирования базидиомицетов — активных продуцентов цел-люлозолитических энзимов по факторам рН питательной среды (значения рН изменялись от 3 до 9 с интервалом 1 ед) и температуры (значения варьировали от 24 °С до 36 °С с интервалом 2 °С). Определяли общую целлюло-золитическую активность всех энзимов комплекса целлюлаз по отношению к фильтровальной бумаге. Установлено, что оптимальное начальное рН питательной среды для всех штаммов равно 7, а температура культивирования — 28 °С для штамма вИ-1 Б1егеит ЫгвиЬит, 32 °С для штамма Апве-1 Daedaleopsis confragosa Г. confragosa и 34 °С для штаммов К-1, А-Дон-02, Д-1 1грех lacteus. В результате оптимизации условий культивирования значения общей целлюлозолитичес-кой активности возросли на 16% для штамма К-1 Irpex lacteus, на 19% — для штамма А-Дон-02 Irpex lacteus, на 107% — для штамма вИ-1 Stereum Ы^иШт и на 159% — для штамма Д-1 Irpex lacteus. В то же время подбор условий культивирования позволил повысить удельную общую целлюлозолитическую активность штамма вИ-1 S. hirsutum на 9%, штамма А-Дон-02 I. lacteus — на 23%, штамма Апве-1 D. confragosa Г. confragosa — на 51% и штамма Д-1 I. lacteus — на 143%. Для штамма J-2An Phellinus pomaceus активность целлю-лаз ни в одном варианте опыта не выявлена. Максимальная общая активность энзимов цел-люлозолитического комплекса для культур К-1, А-Дон-02, Д-1 Irpex lacteus и Апве-1 D. con-fragosa Г. confragosa установлена на 7-е сутки эксперимента, в то время как для культуры вИ-1 S. hirsutum — на 14-е сутки.
CULTIVATION OF BASIDIOMYCETES WHICH ARE ACTIVE PRODUCERS OF CELLULOLYTIC ENZYMES I. Total cellulolytic activity of basidiomycetes cultural liquids
K. G. Dreval M. I. Boyko
Donetsk National University
E-mail: k.dreval@gmail.com
Selection of the cultivation conditions for basidiomycetes which are active producers of cellulolytic enzymes was particular in initial pH of nutrient medium (the factor ranged 1 pH apart from 3 to 9 pH) and cultivation temperature (the factor ranged 2 °C apart from 24 to 36 °C). We determined the overall cellulolytic activity of all enzymes cellulase complex towards filter paper. It was determined that optimal initial pH of the nutrient medium for all strains was equal 7, and cultivation temperature was 28 °C for strain Sh-1 Stereum hirsutum, 32 °C for strain AnSc-1 Daedaleopsis confragosa f. confragosa and 34 °C for strains K-1, A-^oh-02, fl-1 Irpex lacteus. As a result of optimization the values of total cellulolytic activity increased by 16% for strain K-1 Irpex lacteus, 19% for strain A-^oh-02 Irpex lacteus, 107% for strain Sh-1 Stereum hirsutum and 159% for strain fl-1 Irpex lacteus. At the same time, as a result of selection of cultivation conditions specific cellulolytic activity of strain Sh-1 S. hirsutum increased by 9%, A-^oh-02 I. lacteus — by 23%, AnSc-1 D. confragosa f. confragosa — by 51% and fl-1 I. lacteus — by 143%. In strain J-2An phellinus pomaceus cellulase activity was not found.in any variant of the experiment. Maximal total cellu-lolytic activity of enzymes was found in cultural liquids for K-1, A-^oh-02, fl-1 Irpex lacteus and AnSc-1 D. confragosa f. on the 7th day of the experiment, while Sh-1 S. hirsutum — on the 14th day.
enzymes, cultivation temperature, acidity of nutrient medium, optimization, Irpex lacteus, Stereum hirsutum, Daedaleopsis confragosa f. confragosa, Phellinuspomaceus.
