Спросить
Войти
УДК 577.152.321+663.11
КУЛЬТИВУВАННЯ БАЗИДІОМІЦЕТІВ. — АКТИВНИХ ПРОДУЦЕНТІВ ЦЕЛЮЛОЗОЛІТИЧНИХ ЕНЗИМІВ. ІІ. ЕНДОГЛЮКАНАЗНА АКТИВНІСТЬ КУЛЬТУРАЛЬНИХ ФІЛЬТРАТІВ БАЗИДІОМІЦЕТІВ СТОСОВНО Na-КАРБОКСИМЕТИЛЦЕЛЮЛОЗИ
К. Г. Древаль Донецький національний університет
Е-mail: k.dreval@gmail.com
Отримано 06.10.2011
Проведено підбір умов культивування базидіоміцетів — активних продуцентів целюлаз за факторами рН живильного середовища (градації змінювались від 3 до 9 рН із кроком 1 од) і температури (значення змінювались від 24 °С до 36 °С із кроком 2 °С) з метою збільшення синтезу ними ендоглю-каназ (КФ 3.2.1.4). Визначали ензиматичну активність стосовно Na-карбоксиметилцелюлози. Встановлено, що оптимальною початковою кислотністю живильного середовища для всіх штамів є рН 7, а температурою культивування — 24 °С для штамів А-Дон-02 Irpex lacteus, AnSc-1 Daedaleopsis con-fragosa f. confragosa, Sh-1 Stereum hirsutum, 34 °С для К-1 Irpex lacteus та 36 °С для Д-1 Irpex lacteus. У результаті підбору умов культивування значення ендоглюканазної активності зросли в 1,59 раза для штаму Sh-1 Stereum hirsutum, у 2,51 раза для А-Дон-02 Irpex lacteus, у 3,02 раза для К-1 Irpex lacteus, у 3,69 раза для AnSc-1 Daedaleopsis confragosa f. confragosa та у 12,16 раза для штаму Д-1 Irpex lacteus. Водночас, у результаті оптимізації умов культивування питома ендоглюканазна активність штаму К-1 Irpex lacteus зросла у 3,54 раза, А-Дон-02 Irpex lacteus — у 5,12, Д-1 Irpex lacteus — у 7,86 та AnSc-1 Daedaleopsis confragosa f. confragosa — у 17,98 раза. Штам J-2An Phellinus pomaceus не виявив активності ендоглюканаз у жодному варіанті досліду. Максимальну ендоглюка-назну активність щодо Na-карбоксиметилцелюлози для культур К-1, А-Дон-02, Д-1 Irpex lacteus та AnSc-1 D. confragosa f. confragosa встановлено на 7-му добу культивування, тимчасом як для культури Sh-1 S. hirsutum — на 14-ту добу експерименту.
Ключові слова: базидіоміцети, ендоглюканаза, Ка-карбоксиметилцелюлоза, температура
культивування, кислотність середовища, оптимізація, Irpex lacteus, Stereum hirsutum, Daedaleopsis confragosa Г confragosa, PheШnuspomaceus.
Дедалі більшу увагу світова спільнота приділяє пошукові та використанню альтернативних джерел енергії, передусім віднов-лювальних [1]. Розробка технології отримання паливного етанолу з рослинної біомаси та її широке впровадження у виробництво має важливе економічне значення і може розглядатись як один із чинників забезпечення енергетичної незалежності України [2-5]. Одним із факторів, що стримує промислове впровадження таких технологій у виробництво, є нестача високоактивних продуцентів целюлаз. Нами знайдено штами базидіальних грибів, які можуть бути перспективними об’єктами біотехнології целюлаз [6]; наступним етапом дослідження їхньої фізіологічної здатності до гідролізу целюлози є оптимізація фізико-хімічних умов культивування.
Одним з основних ензимів, що входить до складу целюлазного комплексу, є ендоглюканаза, оскільки вона першою атакує
молекули нативної целюлози [7-9]. Специфічним субстратом, стосовно якого визначають активність саме ендоглюканази у складі целюлазного комплексу, є розчин Ка-кар-боксиметилцелюлози [7-11].
Метою роботи було визначення оптимальних значень температури та рН живильного середовища для культивування деяких штамів базидіоміцетів — активних продуцентів целюлозолітичних ензимів для підвищення синтезу ендоглюканази та її активності щодо розчину Ка-карбоксиметилцелюлози.
Матеріали і методи
Визначали вплив початкової кислотності жи виль но го се ре до ви ща та тем пе ра ту ри куль ти ву ван ня на здатність ба зидіоміцетів до синтезу ендоглюканази (КФ 3.2.1.4) у складі целюлозолітичного комплексу. Об’єктами досліджень були 6 штамів вищих
ба зидіаль них грибів, які на по пе реднь о му етапі скринінгу [6] відібрано як активні продуценти целюлозолітичних ензимів: К-1, А-Дон-02 та Д-1 Irpex lacteus (Fr.) Fr.; Sh-1 Stereum hirsutum (Willd.) Pers.; AnSc-1 Daedaleopsis confragosa f. confragosa (Bolton) J. Schrot. та J-2An Phellinus pomaceus (Pers.) Maire.
Для досліджен ня ен дог лю ка наз ної ак -тивності штами культивували на рідкому середовищі Чапека такого складу (г/л): NaNO3 —
Ендоглюканазну активність ензимів у складі целюлозолітичного комплексу культуральних фільтратів (КФ) базидіоміцетів визначали стосовно 2%-го розчину Na-карбоксиметилцелюлози (Sigma, Німеччина). Склад реакційних сумішей під час встановлення ензиматичної активності та умови прове ден ня ре акцій бу ли у строгій від -повідності до рекомендацій IUPAC [9] і загальноприйнятих методик [8, 9]. Обчислюючи результати, за одиницю активності (IU) приймали таку кількість ензиму, яка утворювала 1 мкМ редукуючих цукрів протягом 1 хв в умовах досліду (рН = 4,8; t = 40 “С). Питому активність (IU/mg) визначали за відношенням загальної активності культурального фільтрату (IU/ml) до вмісту протеїнів у культуральному фільтраті (mg/ml). Редуку-ючі цукри оціню ва ли ме то дом Шо модьї-Нельсона (калібрувальний графік будували за глюкозою) [8, 12]. Вміст протеїну в КФ визначали спектрофотометричним методом на спектрофотометрі СФ-46 (Росія) [13].
Усі досліджен ня про во ди ли у трик ратній повторюваності. Статистичну обробку здійснювали методами дисперсійного аналізу, порівняння середніх — методом Дункана [14].
Ре зуль та ти та об го во рен ня
Зміну ендоглюканазної активності щодо розчинів Na-карбоксиметилцелюлози (Na-КМЦ) залежно від різних градацій фізичних та хімічних чинників на Т-му добу культивування подано на рис. 1, а на 14-ту добу — на рис. 2.
Для штаму К-1 I. lacteus (рис. 1, а) характерний один значний пік ендоглюканазної
активності, встановлений за культивування при температурі 34 °С та рН 7. Виявлений максимум перевищує значення ендоглюка-назної активності, визначене за неоптимізо-ваних умов культивування, у 3,02 раза. Якщо взяти до уваги значення активності цього штаму, вищі за 6 ГО/шІ, то можна побачити певне розмежування активності КФ до Ыа-КМЦ у цього штаму: в діапазонах 2426 °С та 32-36 °С за кислотності живильного середовища у межах 5-7 рН. Можна припустити, що в штаму К-1 I. Іа^еш є 2 форми ендоглюканази, які відрізняються за своїми фізико-хімічними оптимумами активності. Це узгоджується з даними літератури, які свідчать про існування двох ендоглюканаз — Еg I та Eg II — у целюлозних комплексах більшості організмів [8, 9, 15, 16]. На 14-ту до бу куль ти ву ван ня ен дог лю ка наз на ак -тивність цього штаму була нижчою порівняно зі значеннями, встановленими на 7 добу експерименту (рис. 2, а).
Для штаму А-Дон-02 I. Іа^еш на 7-му добу куль ти ву ван ня ха рак тер ним є пев ний зсув підви ще ної ак тив ності ен дог лю ка на зи в зону більш високих значень початкового рН живильного середовища (рис. 1, б). Так само, як і в штаму К-1 I. ІаеЬе^, у штаму А-Дон-02 I. Іа^еш виявляється певний розподіл підви ще ної ен дог лю ка наз ної ак тив -ності: за температури культивування 24 °С, 28-30 °С та 34-36 °С при початковій кислотності живильного середовища 7-8 рН. На 14-ту добу культивування встановлено лише один значний пік активності до гідролізу Ыа-КМЦ штаму А-Дон-02 I. ІасЬет (рис. 2, б). При цьому максимуми ендоглюканазної актив ності ць о го шта му, вста нов лені на 7-му та 14-ту добу культивування, достовірно між собою не відрізняються. Однак, на 7-му добу куль ти ву ван ня мак си мум ак тив ності вста -новлено за температури культивування 24 °С, а на 14-ту добу — за 32 °С. Це також може вказувати на існування у штаму А-Дон-02 I. Іа^еш кількох форм ендоглюканази, які розрізня ють ся не ли ше за фізи ко-хімічни ми оптимумами дії, а й за часом їх синтезу. Абсолютне значення максимальної активності КФ до Ыа-КМЦ штаму А-Дон-02 I. Іа^еш перевищує неоптимізоване значення у 2,51 раза.
Ендоглюканазна активність штаму Д-11. Іа^еш на 7-му добу культивування зростала на живильному середовищі з рН 7 при всіх досліджуваних температурах, крім 30 °С та 36 °С, за кислотності живильного середовища 4-7 рН (рис. 1, в). Абсолютне значення макси маль ної ен дог лю ка наз ної ак тив ності ць о -го штаму встановлено на 14-ту добу культи8Í
ву ван ня на жи виль но му се ре до вищі з рН 7 за температури 36 °С. Значення, встановлене за цих умов культивування, перевищувало неоптимізоване значення активності ензимів КФ цієї культури у 12,16 раза. На 14-ту до бу куль ти ву ван ня чітко прос те жу ва -лось роз ме жу ван ня фізи ко-хімічно го оп ти -муму ендоглюканазної активності штаму Д-1 I. Іа^еш, що також може свідчити про існування кількох форм ендоглюканази у целю-лозолітичному комплексі цієї культури.
Ендоглюканазна активність штаму 8Ь-1 5. НГиШт як на 7-му (рис. 1, г), так і на 14-ту (рис. 2, г) добу культивування була достовірно нижчою за ендоглюканазну активність інших досліджуваних штамів. На 7-му добу культивування чітко встановлено зону оптимуму ен-доглюканазної активності цього штаму на живильному середовищі з рН 5-7 та за температури 28-32 °С. На 14-ту добу культивування чітко розмежовуються дві зони підвищеної активності цього штаму до гідролізу Ыа-КМЦ (рис. 2, г). Максимальну ендоглюканазну активність штаму 8Ь-1 Б.Ні^иШт встановлено за культивування на живильному середовищі з рН 7 та температури 24 °С на 14-ту добу експерименту. Значення максимальної активності КФ цього штаму до Ыа-КМЦ перевищувало неоптимізоване значення в 1,59 раза.
Для штаму Аи8е-1 D. confragosa £. еои£га-gosa на 7-му добу культивування є характерним чітке розмежування зон фізико-хімічних оп ти мумів ен дог лю ка наз ної ак тив ності (рис. 1, д), яке втрачається на 14-ту добу експерименту (рис. 2, д). Абсолютне значення максимальної ендоглюканазної активності цього штаму встановлено за температури культивування 32 °С на живильному середовищі з рН 7 на 14-ту добу експерименту, який у 3,69 раза перевищував неоптимізоване значення.
В експерименті за умов дії всіх градацій температури та рН середовища не визначено ен дог лю ка наз ної ак тив ності КФ шта му J-2An Р.рошасеш, що показано на рис. 1, е та 2, е. Зважаючи на те, що в умовах експерименту не виявлялось достовірної різниці за вмістом редукуючих цукрів та протеїнів у КФ цього штаму порівняно з контролем (як на 7-му, так і на 14-ту добу), нормальний ріст у куль турі на кар топ ля но-глю коз но му середовищі, на середовищі Чапека з додаванням глюкози як джерела вуглецю (8 г/л) та на ко пи чен ня в КФ ек зо ген них про теїнів у цьому разі, наявність ендоглюканазної активності стосовно Ыа-КМЦ у штаму J-2An Р.ротасет на етапі скринінгу можна розглядати як артефакт, адже дані не відтворено за пов тор но го про ве ден ня екс пе ри мен ту.
Паралельно з визначенням загальної ен-дог лю ка наз ної ак тив ності у КФ досліджу ва -них штамів розраховували питому активність ензимів базидіоміцетів щодо Na-КМЦ. Результати розрахунків наведено на рис. 3
□ 18-24
□ 12-18
■ 6-12
□ 18-24 □ 12-18 ■ 6-12
іК éÊkr И 0-6
д Рис. 1. Ендоглюканазна активність культуральних фільтратів штамів К-1, А-Дон-02 і Д-1 Irpex lacteus (а, б, в відповідно); Sh-1 Stereum hirsutum
(г); AnSc-1 Daedaleopsis confragosa f. confragosa
(д) та J-2An Phellinus pomaceus (е) залежно від умов культивування на 7-му добу експерименту
і 4. Значення питомої ендоглюканазної активності були вищими за значення загальної активності, що вказує на неістотне накопичення протеїнів у КФ досліджуваних штамів. За умов дії різних градацій зазначених факторів питома ендоглюканазна активність штамів змінювалась не аналогічно до загальної ендоглюканаз-ної активності, що свідчить про неоднорідність накопичення протеїнів у КФ базидіоміцетів.
Пи то ма ен дог лю ка наз на ак тивність куль ту ри К-1 I. lacteus на Т-му добу культивування мала 3 зони підвищеної активності, які знаходились у діапазонах дії температури та рН середовища, близьких до крайніх (рис. 3, а). Максимальне значення питомої активності КФ цього штаму встановлено на живильному середовищі з рН Т та за температури культивування 34 “С. Оптимізоване значення перевищувало неоптимізовану величиа
Рис. 2. Ендоглюканазна активність культуральних фільтратів штамів К-1, А-Дон-02 і Д-1 Irpex lacteus (а, б, в відповідно); Sh-1 Stereum hirsutum
(г); AnSc-1 Daedaleopsis confragosa f. confragosa
(д) та J-2An Phellinus pomaceus (е) залежно від умов культивування на 14-ту добу експерименту
ну питомої активності стосовно Na-КМЦ у 3,54 раза. При цьому максимум активності, встановлений за вказаних умов, достовірно перевищував її значення за умов дії інших градацій рН живильного середовища і температури культивування. На 14-ту добу вирощування питома ендоглюканазна активність КФ культури К-1 I. lacteus мала високі значення при температурі 36 “С (рис. 4, а), однак ендоглюканазна активність за цих умов була достовірно нижчою порівняно з максимумом, встановленим на Т-му добу експерименту.
Для штаму А-Дон-02 I. lacteus мак си мум пи то мої ен дог лю ка наз ної ак тив ності КФ зафіксовано на Т-му добу культивування на жи вильно му се ре до вищі з рН Т та за тем пе -ратури 24 “С (рис. 3, б). Високе значення активності також встановлено за культивування на середовищі з рН 9, однак воно достовірно нижче за максимальне. Оп-тимізоване значення питомої ендоглюканазної активності перевищувало неоптимізова-ну активність цього штаму в 5,12 раза. На 14-ту добу культивування можна побачити
□ 40-60
■ 20-40
■ 0-20
Рис. З. Питома ендоглюканазна активність культуральних фільтратів штамів К-1, А-Дон-02 і Д-1 Irpex lacteus (а, б, в відповідно); Sh-1 Stereum hirsutum (г); AnSc-1 Daedaleopsis confragosa f. confragosa (д) та J-2An Phellinus pomaceus (е) залежно від умов культивування на 7-му добу експерименту певну залежність питомої ендоглюканазної ак тив ності шта му А-Дон-02 I. lacteus від градацій дії рН та температури (рис. 4, б): підвищені значення активності КФ зафіксовано у крайніх варіантах градацій факторів. Мож на при пус ти ти, що такі умо ви є стре со -ви ми для ор ганізму-про ду цента, і як ре ак -ція-відповідь підви щуєть ся син тез шта мом ен дог лю ка на зи, яка бе ре участь у прис то су -ванні гриба до відповідного чинника.
Як на Т-му (рис. 3, в), так і на 14-ту (рис. 4, в) добу культивування штаму Д-1 I. lacteus високу питому ендоглюканазну активність КФ оцінювали за умов дії крайніх градацій рН і температури. Максимальне значення встановлено на Т-му добу культивування на живильному середовищі з рН Т за температури 36 “С (рис. 3, в). Оптимізоване значення активності ензиму в Т,86 раза перевищувало неоптимізоване.
З рис. 3, г та 4, г видно, що питома ендоглюканазна активність штаму Sh-1 S. hirsutum мала дуже вузькі фізико-хімічні оптимуми дії. Максимальне значення активності КФ цього штаму до гідролізу Na-КМЦ встановлено
□ 40-60 □ 40-60
■ 20-40 ■ 20-40
□ 40-60
■ 20-40
□ 40-60 □ 40,0-60,0
■ 20,0-40,0
□ 0-20
I 5 pH, ОД
Рис. 4. Питома ендоглюканазна активність культуральних фільтратів штамів К-1, А-Дон-02 і Д-1 Irpex lacteus (а, б, в відповідно); Sh-1 Stereum hirsutum (г); AnSc-1 Daedaleopsis confragosa f. confragosa (д) та J-2An Phellinus pomaceus (е) залежно від умов культивування на 14-ту добу експерименту на живильному середовищі з рН 5 за температури 32 “С на Т-му добу культивування та на жи виль но му се ре до вищі з рН Т за тем пе ратури 24 “С на 14-ту добу вирощування. При цьому зазначені величини максимальної пи то мої ак тив ності ен зи му дос то вір но між собою не відрізнялись.
Максимум питомої ендоглюканазної активності КФ штаму AnSc-1 D. confragosa f. confragosa на Т-му добу встановлено на середовищі з рН Т за температури 24 “С (рис. 3, д). При цьому значення ендоглюканазної активності штаму AnSc-1 D. confragosa f. confragosa в1Т,98 раза перевищувало неоптимізовану величину, визначену на попередньому етапі. Питома активність КФ цього штаму до Na-КМЦ на 14-ту добу культивування була нижчою порівняно з питомою ендоглюканазною активністю КФ на Т-му добу експерименту (рис. 4, д).
Культуральний фільтрат штаму J-2An P.pomaceus як на Т-му (рис. 3, е), так і на 14-ту (рис. 4, е) добу вирощування питомої ендоглюканазної активності не виявляв.
Таким чином, у результаті проведеної роботи встановлено оптимальні значення рН живильного середовища і температури культивування для синтезу екзоцелюлаз дослідженими базидіоміцетами. Для отримання найбільшого виходу ендоглюканаз, здатних до гідролізу Na-КМЦ, штами А-Дон-02 I. lacteus, Sh-1
S. hirsutum та AnSc-1 D. confragosa f. confragosa слід культивувати на живильних середовищах з рН Т за температури 24 “С, штам Д-1 I. lacteus — на живильному середовищі з рН Т за 36 “С, а штам К-1 I. lacteus — на живильному середовищі з рН Т за 34 “С.
Роботу виконано за спонсорської підтримки громадської організації «Развитие» (Росія).
ЛІТЕ РА ТУ РА
базидіальних грибів // Біотехнологія. — 2011. — Т. 4, № 1. — С. 87-92.
П. ЭНДОГЛЮКАНАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ КУЛЬ ТУ РАЛЬ НЫХ ФИЛЬТ РА ТОВ БАЗИДИОМИЦЕТОВ ПО ОТНОШЕНИЮ К Na-КАРБОКСИМЕТИЛЦЕЛЛЮЛОЗЕ
К. Г. Древаль Донецкий национальный университет Е-mail: k.dreval@gmail.com
Проведен подбор условий культивирования базидиомицетов — активных продуцентов цел-люлаз по факторам рН питательной среды (градации фактора изменялись от 3 до 9 рН с шагом 1 ед) и температуры (значения изменялись от 24 “С до 36 “С с шагом 2 “С) с целью повышения синтеза ими эндоглюканаз (КФ 3.2.1.4). Энзиматическую активность определяли по отношению к Na-карбоксиметилцеллюлозе. Установлено, что оптимальной начальной кислотностью питательной среды для всех штаммов является рН Т, а температурой культивирования — 24 “С для штаммов А-Дон-02 Irpex lacteus, AnSc-1 Daedaleopsis confragosa f. confragosa, Sh-1 Stereum hirsutum, 34 °С для К-1 Irpex lacteus и 36 “С для Д-1 Irpex lacteus. В результате подбора условий культивирования значения эндоглюканазной активности возросли в 1,59 раза для штамма Sh-1 Stereum hirsutum, в 2,51 раза для А-Дон-02 Irpex lacteus, в 3,02 раза для К-1 Irpex lacteus, в 3,69 раза для AnSc-1 Daedaleopsis confragosa f. confragosa и в 12,16 раза для Д-1 Irpex lacteus. В то же время в результате оптимизации условий культивирования удельная эндоглюканазная активность штамма К-1 Irpex lacteus возросла в 3,54 раза, А-Дон-02 Irpex lacteus — в 5,12 раза, Д-1 Irpex lacteus — в Т,86 раза и AnSc-1 Daedaleopsis confragosa f. confragosa — в 1Т,98 раза. Штамм J-2An Phellinus pomaceus не проявил эндоглюканазной активности ни в одном варианте опыта. Максимальная активность эндоглюканаз относительно Na-карбоксиметилцелюлозы для культур К-1, А-Дон-02, Д-1 Irpex lacteus и AnSc-1 D. confragosa f. Confragosa установлена на Т-е сут культивирования, в то время как для культуры Sh-1
S. hirsutum — на 14-е сут эксперимента.
воразрушающих грибов. Автореф. дис. ... канд. биол. наук. — К., 1975. — 28 с.
SELECTION OF CULTIVATION CONDITIONS FOR BASIDIOMYCETES — ACTIVE PRODUCERS OF CELLULOLYTIC ENZYMES.
П. ENDOGLUCANASE ACTIVITY OF CULTURAL LIQUIDS TOWARDS Na-CARBOXYMETHYLCELLULOSE
К. G. Dreval
Donetsk National University
Е-mail: k.dreval@gmail.com
To increase endoglucanase (EC 3.2.1.4) production, selection of the cultivation conditions of basidiomycetes — active cellulolytic enzymes producers — was conducted along nutrient medium initial acidity (factor was changed between 3 and 9 pH with 1 pH step) and cultivation temperature (factor was changed between 24 and 36 “С with a step of 2 “С). Endoglucanase activity towards Na-carboxymethylcellulose was determined in the selection process. It was determined that optimal initial acidity of the nutrient medium for all strains was Т pH, and cultivation temperature was 24 “С for the strains А-Дон-02 Irpex lacteus, AnSc-1 Daedaleopsis confragosa f. confragosa, Sh-1 Stereum hirsutum, 34 “С for the strain К-1 Irpex lacteus and 36 “С for the strain Д-1 Irpex lacteus. As the result of optimization, the values of endoglucanase activity increased at 1,59 times for the strain Sh-1 Stereum hirsutum, at 2,51 times for the strain А-Дон-02 Irpex lacteus, at 3,02 times for the strain К-1 Irpex lacteus, at 3,69 times for the the strain AnSc-1 Daedaleopsis con-fragosa f. confragosa and at 12,16 times for the strain Д-1 Irpex lacteus. At the same time, as the result of selection of cultivation conditions, specific endoglucanase activity of strain К-1 Irpex lacteus was increased at 3,54 times, А-Дон-02 Irpex lacteus — at 5,12 times, Д-1 Irpex lacteus — at Т,86 times and AnSc-1 Daedaleopsis confragosa f. confragosa — at 1Т,98 times. Culture J-2An Phellinus pomaceus shown absence of endoglu-canase activity in any experiment. Maximal endoglu-canase activity of enzymes in cultural liquids of strains К-1, А-Дон-02, Д-1 Irpex lacteus and AnSc-1 D. confragosa f. confragosa was established on the day of cultivation, and for strain Sh-1 S. hirsutum — on the 14th day of the experiment.
