УДК 577.151.4
МОДУЛЯЦИЯ ДЕЙСТВИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ НУКЛЕАЗЫ КРОЛИКА S-АДЕНОЗИЛ-Х-МЕТИОНИНОМ
Д.Е. Соболев1, Б.Ф. Ванюшин2
(кафедра биохимии; e-mail: morang@list.ru)
В экстракте из митохондрий печени кролика обнаружена эндонуклеазная активность, которая по свойствам сходна с животной эндонуклеазой G. Эта активность выявлена в белковой фракции с молекулярной массой около 30 кДа, она стимулируется ионами Mg2+ и ингибируется ионами Zn2+. В отличие от растительных эндонуклеаз WEN1 и WEN2 она не чувствительна к статусу метилирования субстратных ДНК и ингибируется S-аденозил-L-метионином.
Эндонуклеаза G, изначально обнаруженная в ядрах незрелых куриных эритроцитов, получила свое название за предпочтительное расщепление последовательностей (dG)n • (dC)n при n > 9 [1]. Позже было показано, что фермент локализован в межмембранном пространстве митохондрий [2, 3]. Эндонуклеаза G кодируется в ядре и содержит на N-кон-це сигнальную последовательность, обеспечивающую транспорт фермента в митохондрии [4]. Она найдена у животных и грибов, есть также указания на возможное ее наличие у растений [5].
Эндонуклеаза G принадлежит к семейству ßßa-Ме-finger ДНК/РНК-неспецифичных нуклеаз. Она присутствует в клетке в форме гомодимера с молекулярной массой субъединиц около 29 кДа [3, 6]. Активность эндонуклеазы G зависима от ионов Mg2+ и Mn2+ и ингибируется ЭДТА, ионами Zn2+ и Fe2+ и высокой ионной силой (свыше 50—75 мМ KCl). Фермент активен в широком диапазоне pH (от 5 до 9). Эндонуклеаза G расщепляет РНК, одно- и двухцепо-чечные ДНК с образованием 3&-OH и 5&-фосфатной группы [1, 3, 7, 8].
Предполагается, что эндонуклеаза G может участвовать в репликации и репарации мтДНК [9—11]. Она участвует в деградации ядерной ДНК при запрограммированной гибели клеток (ЗГК). Высвобождение эндонуклеазы G из межмембранного пространства митохондрий (совместно с цитохромом c и другими белками) происходит при воздействии продуцированного каспазой-8 белка tBID [12]. Высвобожденная эндонуклеаза G осуществляет межнуклеосомную фрагментацию ядерной ДНК [13]. Роль эндонук-леазы G в ЗГК подтверждается фенотипическими
изменениями у нокаутных по ее гену организмов, в том числе нарушениями фрагментации ДНК при ЗГК [14, 15].
Ранее мы выделили и охарактеризовали эндонуклеазы WEN1 и WEN2 из содержащих митохондрии везикул, образующихся в гибнущих клетках колеоптиля пшеницы Triticum aestivum L. [16, 17]. Предположительно, они могут принимать участие в запрограммированной гибели клеток колеоптиля. Мы показали их чувствительность к статусу метилирования субстратной ДНК и регуляцию их активности S-аденозил-Х-метионином и его аналогами, что характерно также для бактериальных эндонук-леаз рестрикции [18]. По некоторым своим свойствам (молекулярная масса, зависимость ферментативной активности от ионов двухвалентных металлов, предположительно митохондриальная локализация) эндонуклеаза пшеницы WEN1 сходна с эндонуклеазой G. До сих пор не было убедительно доказано наличие эндонуклеазы G у растений, хотя сходный по свойствам фермент был обнаружен в межмембранном пространстве митохондрий растений Arabidopsis thaliana и частично охарактеризован [5].
До сих пор о возможной модуляции действия эндонуклеаз животных S-аденозил-Х-метионином сведения в литературе отсутствуют.
В настоящей работе мы иследовали влияние S-аде-нозил-Х-метионина (SAM) и его лишенного метиль-ной группы аналога S-аденозил-Х-гомоцистеина (SAH) на эндонуклеолитическую активность, выделенную из митохондрий печени кролика, а также изучили зависимость этой активности от статуса метилирования расщепляемой ДНК.
Сокращения: БСА — бычий сывороточный альбумин, ДТТ — дитиотреитол, ЗГК — запрограммированная гибель клеток, TBE — Tris-боратный буфер, содержащий ЭДТА, ФМСФ — фенилметилсульфонилфторид, SAH — S-аденозил-Х-гомоцистеин, SAM — S-аде-нозил-Х-метионин.
Материалы и методы
Выделение митохондрий и экстракция белка
Выделение митохондрий производили при 4°С. Ткань свежеизвлеченной печени кролика Oryctola-gus cuniculus L. помещали в буфер для гомогенизации (25 мМ HEPES-NaOH pH 7,5, 150 мМ NaCl, 300 мМ сахароза, 5 мМ ЭДТА • Na, 2,5 мМ ДТТ, 1 мМ ФМСФ), 5 мл буфера/г ткани. Ткань гомогенизировали в ножевом гомогенизаторе и затем в поршневом стеклянном гомогенизаторе. Гомогенат дважды фильтровали через 4 слоя марли.
Отфильтрованный гомогенат дважды центрифугировали 10 мин при 750 g для удаления тяжелых органелл и недоразрушившихся клеток и полученные осадки отбрасывали. Супернатант фильтровали через 2 слоя марли.
Супернатант центрифугировали 15 мин при 17 500 g. Полученный супернатант отбрасывали, предварительно удалив с его поверхности остатки липи-дов. Верхнюю коричневую часть осадка ресуспенди-ровали в небольшом объеме буфера для гомогенизации, переносили в чистые центрифужные стаканы и дважды промывали буфером для гомогенизации. Промытый осадок ресуспендировали в буфере хранения (50 мМ HEPES-NaOH pH 7,5, 100 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА • Na, 2,5 мМ ДТТ, 1 мМ ФМСФ, 15% глицерин), 0,1 мл буфера/г исходной ткани печени.
Для экстракции белков из полученной суспензии митохондрий к ней добавляли 1 объем буфера лизиса (50 мМ HEPES-NaOH pH 7,5, 500 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА • Na, 2,5 мМ ДТТ, 1 мМ ФМСФ, 1%-й Тритон X-100). Смесь гомогенизировали в стеклянном поршневом гомогенизаторе и инкубировали при 4°С в течение 20 мин при помешивании. Полученный лизат центрифугировали 120 мин при 48 400g и отбирали супернатант — суммарный экстракт митохондрий.
Определение эндонуклеазной активности
В качестве субстрата для определения эндонук-леазной активности использовали dam, dcm-мети-лированную (+) и неметилированную (—) ДНК фага X (Fermentas) или их смесь в пропорции 1: 1 (в опытах, где статус метилирования субстратной ДНК не указан). Метилированная фаговая ДНК содержит остатки 5-метилцитозина в последовательностях Cm5CWGG и ^-метиладенина в последовательностях Gm6ATC. Реакционная смесь объемом 10 мкл содержала 0,6 мкг ДНК, 10 мМ HEPES-NaOH pH 7,5, 0,5 мкл мито-хондриального экстракта (контроль), а также, где это указано, S-аденозил-Х-метионинхлорид, S-аденозил-Z-гомоцистеин, MgCl2 и ZnSO4 (опыт). Смеси инкубировали при 37°С в течение 2 ч, добавляли 2 мкл 6х буфера для нанесения на гель (10 мМ Трис-HCl pH 7,6, 0,03% бромфеноловый синий, 0,03% ксилен-цианол, 60% глицерин, 60 мМ ЭДТА) (Fermentas) и наносили на 0,75%-й агарозный гель в трис-боратном буфере pH 8,3, содержащем 0,0005%-й бромистый этидий. Электрофорез проводили при напряжении 7,5 В/см до пробега бромфенолового синего 7 см в геле и продукты гидролиза ДНК визуализировали в УФ-свете.
Электрофорез белков в полиакриламидном геле. Разделение белков производили по методике Laemmli (Laemmli 70) в 4%-м концентрирующем и 12%-м разделяющем гелях. Гели окрашивали нитратом серебра по методике [20].
Определение эндонуклеазной активности в геле. В разделяющий полиакриламидный гель для вертикального электрофореза белков при его приготовлении добавляли ДНК из тимуса теленка до конечной концентрации 40 мкг/мл. После электрофореза гель для удаления SDS однократно промывали в 0,5%-м растворе Тритон X-100 в течение 20 мин и четырехкратно в дистиллированной воде в течение 20 мин. Затем гель переносили в буфер, содержащий 25 мМ Трис-HCl pH 7,5, 10 мМ MgCl2, 10 мМ CaCl2, и инкубировали в течение ночи в закрытой чашке Петри при 37°С. Затем в буфер с гелем добавляли бромистый этидий до концентрации 0,0025% и после 15 мин инкубации зоны гидролиза ДНК в визуализировали в УФ-свете.
Определение концентрации белка производили по микроварианту метода Bradford [21] с использованием БСА в качестве стандарта.
Результаты и их обсуждение
Митохондрии печени кролика были выделены при помощи дифференциального центрифугирования на основе описанных в литературе методик [22, 23]. В экстракте из них была обнаружена нуклеазная активность с кажущейся молекулярной массой около 30 кДа (рис. 1), что соответствует массе мономера эндонуклеазы G [3]. Эндонуклеазная активность, присутствующая в митохондриальном экстракте, стимулируется ионами Mg2+ и ингибируется ионами Zn2+ (рис. 1), что тоже характерно для эндонуклеазы G [7].
Исследована зависимость действия эндонукле-азной активности митохондриального экстракта на субстратные ДНК от статуса их метилирования и от S-аденозил-Х-метионина и S-аденозил-Х-гомо-цистеина. В качестве субстрата использованы не-метилированная (dam—, dcm—) и метилированная по сайтам Gm6ATC и Cm5CWGG (dam+, dcm+) ДНК фага X. Эти ДНК идентичны по длине, нукле-отидной последовательности и концентрации в реакционной смеси. Найденная эндонуклеаза расщепляет оба эти субстрата примерно одинаково (рис. 2), что отличает ее от эндонуклеаз пшеницы WEN1 и WEN2, предпочтительно расщепляющих соответственно метилированную и неметилированную ДНК [16, 17].
S-аденозил-Х-метионин заметно подавляет расщепление субстратных ДНК в присутствии ионов Mg2+. S-аденозил-Х-гомоцистеин, который по сравнению с SAM не имеет метильной группы, не влияет
К Mg Е Mg
Рис. 1. А — эндонуклеазная активность суммарного белкового экстракта митохондрий в 12% ПААГ с вплавленной в гель тимусной ДНК; Б — зависимость эндонуклеазной активности суммарного белкового экстракта митохондрий (800 нг белка) от ионов Mg2+ и Zn2+ (5 мМ). K — контроль, E — ионы металлов не добавлялись
на эндонуклеазную активность (рис. 2). Это отличает изученную животную митохондриальную эндонуклеазную активность от пшеничной эндонуклеа-зы WEN1, которая, напротив, активируется SAM, SAH и SiBA [16].
Таким образом, эндонуклеазная активность из экстракта митохондрий кролика, соответствующая по свойствам эндонуклеазе G, не различает субстратные ДНК по статусу их метилирования. Чувствительность к статусу метилирования субстратной ДНК известна для охарактеризованных нами эндонукле-аз проростков пшеницы WEN1 и WEN2 [16, 17]
К SAM SAH
. + - + - + - +
Рис. 2. Зависимость эндонуклеазной активности суммарного белкового экстракта митохондрий (800 нг белка) от SAM и SAH (2 мМ) и статуса метилирования субстратной ДНК (—, dam, dcm-неметилированная ДНК; +, dam, dcm-метилированная ДНК) в присутствии Mg2+ (5 мМ). К — контроль
и некоторых бактериальных эндонуклеаз рестрикции (в том числе принадлежащих, как и эндонук-леаза G, к рра-Ме-А^ег-семейству) [24, 25]. Реакция митохондриального фермента животных на SAM (ингибирование активности) противоположна характерной для SAM-зависимых эндонуклеаз рестрикции и WEN1 активации под действием SAM. Поэтому, в отличие от известных растительных и бактериальных эндонуклеаз, SAM не является позитивным алло-стерическим эффектором для животной митохонд-риальной эндонуклеазы.
CnHCOK ËHTEPATyPH
Поступила в редакцию 15.05.12
MODULATION OF THE RABBIT MITOCHONDRIAL ENDONUCLEASE ACTION
BY S-ADENOSYL-Z-METHIONINE
D.E. Sobolev, B.F. Vanyushin
Endonuclease activity found in rabbit liver mitochondrial extract is similar to known endonuclease G: it has an apparent molecular mass value of about 30 kDa, it depends on Mg2+ and is inhibited with Zn2+. Unlike WEN1 and WEN2 plant endonucleases it is unsensitive to DNA methylation status and inhibited with S-adenosyl-L-methionine.
Сведения об авторах
Соболев Дмитрий Евгеньевич — специалист, науч. сотр. ГНУ ВНИИСБ Россельхозакадемии. Тел.: 8-495-939-54-12, +7-903-204-48-27; e-mail: morang@list.ru
Ванюшин Борис Федорович — докт. биол. наук, проф., чл.-корр. РАН, зав. отделом молекулярных основ онтогенеза, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ. Тел.: 8-495-939 54-12, e-mail: vanyush@belozersky.msu.ru