Исследование экосистемы лечебной нефти Нафталанского месторождения как среды обитания микроорганизмов

УДК 579.22

https://doi.org/10.24411/2310-8266-2018-10404

Исследование экосистемы лечебной нефти Нафталанского месторождения как среды обитания микроорганизмов

А.Г. Талыблы1, В.А. Адигезалова2

E-mail: ajdartalibli@mail.ru

E-mail: vkar22@yandex.ru

Резюме: Рассмотрены горизонты Нафталанского месторождения с лечебной нефтью, которые отличаются низкой бактериальной заселенностью. Предполагается, что причиной этого является сложный состав углеводородов, трудно вовлекаемых в обмен большинством микроорганизмов, а также реакция рН пластовой воды. Показано, что в горизонтах с лечебной нефтью широкое распространение получили представители углеводородокисляющих бактерий родов: Pseudomonas, Bacillus и Rhodococcus. Доказывается, что в лечебных свойствах нафталановой нефти немаловажная роль принадлежит бактериям рода Bacillussubtilis и Rhodococcus. Указывается на возможность использования данных микроорганизмов в целях восстановления биологической активности отработанной лечебной нефти, а также для преобразования в лечебные легких промышленных нефтей из более глубоких горизонтов Нафталанского месторождения. Ключевые слова: лечебная нефть, Нафталанское месторождение, углеводородокис-ляющие микроорганизмы.

Для цитирования: Талыблы А.Г., Адигезалова В.А. Исследование экосистемы лечебной нефти Нафталанского месторождения как среды обитания микроорганизмов // Не-фтеГазоХимия. 2018. № 4. С. 22-26. D0I:10.24411/2310-8266-2018-10404

STUDY OF THE MEDICINAL OIL ECOSYSTEM OF THE NAFTALAN FIELD, AS THE HABITAT OF MICROORGANISMS Ajdar G. Talibli1, Vafa A. Adigozalova2

E-mail: ajdartalibli@mail.ru

Abstract: It was found that the horizons of the Naftalan field with medicinal oil are characterized by a low bacterial population. The reason for this is assumed to be the complex composition of hydrocarbons that are difficult to be involved in the exchange of most microorganisms, as well as the reaction of the pH of produced water. It has been shown that representatives of hydrocarbon-oxidizing bacteria of the genera: Pseudomonas, Bacillus and Rhodococcus are widely used in the horizons with therapeutic oil. It is proved that in the therapeutic properties of naphthalan oil the main role belongs to the bacteria of the genus Bacillus subtilis and Rhodococcus sp. It indicates the possibility of using these microorganisms in order to restore the biological activity of spent medicinal oil, as well as for the conversion into therapeutic, light industrial oil from the deeper horizons of the Naftalan field. Keywords: therapeutic oil, Naftalan field, hydrocarbon-oxidizing microorganisms.

For citation: Talybly A.G., Adigozalova V.A. STUDY OF THE MEDICINAL OIL ECOSYSTEM OF THE NAFTALAN FIELD, AS THE HABITAT OF MICROORGANISMS. OilGasChemistry.2018, no. 4, pp. 22-26. DOI:10.24411/2310-8266-2018-10404

Нафталанское месторождение приобрело широкую известность благодаря исключительным лечебным свойствам своей нефти, больше известной, как нафталан. С 1926 года изучение лечебных свойств нафталанской нефти и разработка месторождения были поставлены на государственный уровень. Всестороннее изучение нафта-ланской нефти показало, что лечебной нефтью насыщена только верхняя часть геологического разреза отложений основной нефтеносной толщи Нафталанского месторождения Майкопской свиты. В нижней ее части залегает легкая промышленная нефть. Исследования на выявление феномена лечебных свойств нафталанской нефти в основном были направлены на поиск углеводородов, обладающих терапевтическим действием. В итоге многолетних исследований в середине 40-х годов было выдвинуто предположение, что лечебные свойства нафталана связаны с содержанием в его составе полициклических нафтеновых углеводородов с короткими боковыми радикалами (производные циклопен-танопергидрофенантрена). Именно такая четырехядерная система нафтеновых углеводородов имеется в составе таких жизненно важных веществ, как стерины, женские и мужские половые гормоны (андрогены, эстрогены), витамин й, кортикостероиды, желчные кислоты и т.д. [1]. Известно, что подобные биологические активные вещества могут продуцировать некоторые микроорганизмы.

Следует отметить, что активное изучение нафталана совпало с эрой развития нефтяной микробиологии. В этот период появились первые сообщения об обнаружении микроорганизмов в нефтяных пластах [2]. Несколько позже появились сообщения о наличии микроорганизмов, окисляющих нефтяные углеводороды в горизонтах с лечебной нефтью Нафталанского месторождения [3, 4]. В настоящее время

Таблица 1

микрофлора большинства нефтяных месторождений достаточно изучена. Микрофлора лечебной нефти Нафта-ланского месторождения остается практически неисследованной.

В задачу настоящей работы ставилось исследование микроорганизмов, населяющих горизонты Нафталанско-го месторождения с лечебной нефтью. Целью являлось определение влияния микроорганизмов на лечебные свойства нафталанской нефти.

Материалы и методы исследований

Объектом исследования явилась лечебная нефть и пластовая вода Нафталанского месторождения. Лечебная нафталанская нефть имеет слабокислую реакцию, рН = 6,9, высокий удельный вес (0,91-0,96). Высокая плотность нафталана обусловлена его фракционным и химическим составом, главным образом наличием большого количества нафтеновых и ароматических углеводородов, в ней почти не содержатся легкие фракции (бензин, керосин, лигроин).

Химический состав лечебной нефти:

Сопутствующая пластовая вода по химическому составу относится к гидрокарбонатно-натриевому типу. Реакция воды варьирует в пределах рН 7,9-8,2. Минерализация воды колеблется в пределах 29,4-34,8 мг/экв. Сопутствующая вода отличается высоким содержанием йода и брома 3,2-9,4 мг/100 мл, в своем составе содержит все микроэлементы, имеющиеся в лечебной нефти (табл. 1).

Пробы нефти и воды для проведения микробиологических исследований отбирались на устье скважины, подающей водонефтяную смесь из горизонта с лечебной нефтью. Микроорганизмы выявлялись методом посева бактериальной суспензии исследуемых образцов на элективные питательные среды в соответствии с [5, 6], а также общепринятыми микробиологическими методами [7, 8, 9]. Дифференциация бактерий по биохимическим свойствам - оксидазной, каталазной активности и принадлежностью к грамотри-цательному или грамположительному виду определяли в соответствии с [10]. Оксидазную активность определяли с использованием свежеприготовленного 1%-го водного раствора тетраметил-п-фенилендиамина гидрохлорида. Каталазную активность определяли нанесением на предметное стекло капли 3%-го раствора перекиси водорода, на которую петлей вносили исследуемую суточную культуру микроорганизмов. Эмульгируя 3%-й водный раствор КОН на предметном стекле с биомассой исследуемых микроорганизмов с использованием теста Гре-герсена, определяли принадлежность

Химический состав сопутствующей пластовой воды из горизонта с лечебной нефтью

Результаты химического анализа Эквивалент Эквивалент Соленость по Пальмеру

г/100г мг/л мг/экв. %

N + ^ 0,4126 41,50,74 180,467 48,50 Первая соленость

Са2+ 0,0024 24,14 1,205 0,32 S176,86

Mg2+ 0,0053 53,31 4,388 1,18 Вторая соленость

Всего катионов 186,467 38,430 S20,00

Ce 0,5040 5069,74 142,999 0,00 Первая щелочность

HCO3 0,2306 2319,61 38,026 А 20,14

RCOO 0,0558 561,29 3,925 1,05 а 3,01

HB4O7 0,0172 173,01 1,109 0,30

Всего катионов 186,059

N8^3 - 0,1

микроорганизмов к грамотрицательному или грамположи-тельному виду. Тинкториальные свойства (формы, размеры, подвижность) изучали методом фазово-контрастной микроскопии. Анаэробные бактерии рода Оези^оуНэпо выявлялись на жидкой минеральной среде, с внесением 3,5 г/л лактата натрия [11]. Для получения накопительных культур и выделения микроорганизмов, окисляющих нефтяные углеводороды, в качестве основы использовали минеральную среду, содержащую в литре водопроводной воды (г/л) К2НР04 - 2,0; Nа2HPO4 - 3,0; N^N03 - 2,0 МдБ04- 0,2; СаС12 - 0,01; МпБ04 -0,02; Fе2S N80! - 5,0; рН = 7,5. Аэробная сапрофитная микрофлора выделялась на стандартной агаризованной среде (МПА). Посевы инкубировали в термостате при температуре 2830 °С в течение 15 суток и на МПА трое суток. Результаты анализировались методом простого визуального наблюдения, а также методом фазово-контрастной микроскопии.

Результаты исследований и их обсуждение

Как видно из табл. 2, сопутствующая пластовая вода из горизонта с лечебной нефтью отличается низкой бактериальной заселенностью. Сапрофитные бактерии на МПА-среде, а также сульфатредуцирующие бактерии на лактатно-натриевой среде не обнаружены. На жидкой минеральной среде с добавлением лечебной нефти в качестве единственного органического вещества обнаружено до 104 клеток/мл углеводородокисляющих бактерий. Указанные микроорганизмы на агаризованной МПА-среде образуют гладкие, округлой формы желтовато-прозрачные бактериальные колонии. Методом микроскопии установлено, что вырастающие на МПА-среде бактерии образуют интенсивно двигающиеся, спор не образующие палочковидные бактерии размером (2-3х0,6 мкм).

Таблица 2

Микробиологические исследования сопутствующей пластовой воды из горизонта с лечебной нефтью Нафталанского месторождения

Образец Гетеротрофные сапрофитные нафталана й бактерии Сульфатредуцирующие бактерии Углеводородоокисляющие бактерии

№ 1 Не обнаружены Не обнаружены 104 клеток/мл

НефтеГазоХимия 23

Отмечено, что указанные микроорганизмы при развитии на этиловом спирте в течение семи суток окрашивают среду в зелено-желтый цвет. В ходе биохимических исследований установлено, что выделенные из пластовой воды бактерии являются грамотрицательными, оксида-за- и каталазаположительными. По совокупности проведенных исследований с помощью определителя бактерий [12] указанные микроорганизмы идентифицированы, как Pseudomonas fluorescents (фото 1), которые, как Ps. putida и Ps. Aeruginosa, являются представителями флюоресцирующих бактерий рода Pseudomonas. Все эти микроорганизмы синтезируют водорастворимый зелено-желтый флюоресцирующий пигмент. Фотоснимки микроорганизмов, представленные в настоящей статье, сделаны в фазовом контрасте и при 1000-кратном увеличении микроскопа.

Фото 1

Pseudomonas fluorescents

При микроскопии непосредственно лечебной нефти выявлено, что в самом слое нефти сосредоточена масса шарообразных бактериальных клеток (от 0,2 до 50 мкм и более), идентифицированных как L-формы Bacillus subtilis (фото 2), и бактериальные клетки в виде кокков, идентифицированные как актинобактерии рода Rhodococcusps (фото 3).

Фото 2

L-формы Bacillus subtilis в лечебной нафталанской нефти

Фото 3

Bacillus subtilis и актинобактерии рода Rhodococcussp в слое лечебной нефти

При стерилизации в автоклаве в течение 20 мин, при давлении 1 атм. шарообразные клетки Bacillus subtilis распадаются на мелкие светящиеся формы (фото 4).

Фото 4

L-формы Bacillus сразу после стерилизации

f , ■ V о

Ï Ф & * 11 и

■ 1f. и » f

е » Р i V

Щ ■ е » 7 * - *ь

■ ■ - * Ф

# v L По прошествии 30 суток после стерилизации L-формы Bacillus subtilis реверсируют в крупные и мелкие шарообразные формы (фото 5).

Было установлено, что при росте на питательной среде с сахарной патокой Bacillus subtilis подкисляют среду, что является одним из важных биохимических свойств, присущих этим микроорганизмам [13]. На агаризованной среде с сахарной патокой Bacillus subtilis образуют колонии, состоящие из центральной зоны, врастающей в среду. При микроскопии препаратов из указанных колоний в поле зрения микроскопа наблюдались прямые палочковидные клетки различных размеров (2-3х06 мкм) с терминальным расположением спор. Установлено, что выявленные аэробные бактерии являются оксидаза, каталаза и грамположитель-ными организмами. По совокупности физиологических, тинкториальных, биохимических исследований, подкисле-ния среды при росте с сахарной патокой, устойчивости к термическому воздействию, склонности к образованию L-форм, эти микроорганизмы идентифицированы, как бактерии рода Bacillus subtilis.

Фото 5

L-формы Bacillus subtilis через 30 суток после стерилизации

Указанные бактерии присутствуют в лечебной нефти в виде L-форм. Образование L-форм для Bacillus subtilis является одним из способов защиты от неблагоприятных условий. Способность возвращаться в состояние нормальных вегетативных клеток после исключения фактора, вызвавшего их образование, указывает на то, что эти бактерии относятся к нестабильным L-формам Bacillus subtilis. Обнаруженные в слое нефти совместно с Bacillus subtilis и бактериальные клетки в виде кокков при росте на МПА-среде, по форме колоний и морфологических циклов (чередования кокков и коротких палочек), способности к росту при 25-30 °С идентифицированы как бактерии рода Rhodococcus sp. Как было установлено, Bacillus subtilis и бактерии рода Rhodococcus sp. развиваются в слое лечебной нефти, бактерии рода Pseudomonas fluorescents окисляют нефть на границе водонефтяного контакта (фото 6).

Фото 6

L-формы Bacillus subtilis и Rodococcussp в нефтяном слое и Pseudomonas fluorescents на границе водонефтяного контакта

ГГ/ТП

s 1 . х

• « ) \

ч • • о „V л к

V" * •

В процессе биохимических исследований было установлено, что выделенные из горизонтов с лечебной нефтью микроорганизмы Pseudomonas fluorescents, Bacillus subtilis и Rhodococcus sp. отличаются биохимической активностью, способностью развиваться за счет метилциклопентана, гексодексана, этанола, глюкозы, дизельного топлива, используя их в качестве единственного органического источника. Кроме этого, Bacillus subtilis являются активными продуцентами биологически активных веществ антимикробного действия (ауксин, стерин, аминокислоты), обладающих антагонистической активностью к широкому спектру патогенных и условно патогенных микроорганизмов [13, 14].

Заключение

Исследована экосистема лечебной нефти Нафталанско-го месторождения как среды обитания микроорганизмов. Низкая бактериальная заселенность горизонтов с лечебной нефтью связывается в первую очередь со сложной структурой углеводородов, а также со значениями реакции пластовой воды рН=7,9-8,2, которые являются пограничными для развития большинства микроорганизмов. Возможно, указанный фактор явился одной из причин приспособления бактерий рода Bacillussubtilis и Rhodococcus sp. для развития непосредственно в лечебной нефти, реакция которой рН=6,9. Углеводородокисляющие бактерии обычно окисляют гидрофобные углеводороды на границе водонефтяного контакта, их развитие в нефти возможно при наличии эмульсионной воды. Автор, изучавший полициклические углеводороды лечебной нефти, отмечал, что лечебная нефть образует с водой стойкую эмульсию [15]. Способность бактерий рода Bacillus subtilis и Rhodococcus sp. развиваться непосредственно в лечебной нефти подтверждает наличие в лечебной нефти эмульсионной воды. На возможность развития микроорганизмов в нефтяном слое в процессе контакта с водонефтяной эмульсией указывают ряд авторов [16, 17].

Авторы, изучавшие нефтяные месторождения, отмечали, что в нефтяных пластах, как правило, формируется биоценоз, состоящий из углеводородокисляющих бактерий и ассоциации микроорганизмов, вовлекающих в свой обмен продукты их биодеградации [16]. В горизонтах с лечебной нефтью, в отсутствие ассоциации микроорганизмов, продукты метаболизма углеводородокисляющих бактерий концентрируются в среде их обитания. Этим можно объяснить факт, что единственно в лечебной на-фталановой нефти обнаруживаются биологически активные вещества [18, 19].

Данные исследований свидетельствуют, что в верхних горизонтах Нафталанского месторождения сложились исключительные экологические условия, определившие возникновение феномена лечебных свойств нафталанской нефти: наличие сложных углеводородов, недоступных для большинства микроорганизмов; способность лечебной нефти образовывать стойкую водонефтяную эмульсию; отсутствие легких фракций и ассоциации микроорганизмов, способных вовлекать в свой обмен продукты метаболизма углеводородокисляющих бактерий.

Следует отметить, что извлекаемая из нефтяных скважин лечебная нефть на 90% состоит из воды и на 10% из нефти, для лечения используется водонефтяная эмульсия, состоящая на 90% из лечебной нефти и 10% пластовой воды. Как было показано, бактерии рода Pseudomonas fluorescents окисляют углеводороды лечебной нефти, развиваясь на границе водонефтяного контакта, соответственно продукты их метаболизма разбавляются в пластовой воде, лечебные свойства которой не имеют большого практического значения. Бактерии рода Rhodococc sp. и Bacillus subtilis развиваются в лечебной нефти, продукты их метаболизма концентрируются непосредственно в лечебной нефти. В ле4 • 2018

НефтеГазоХимия 25

чебных целях используется именно лечебная нефть, представляющая собой фактически водонефтяную суспензию, содержащую биологически активные микроорганизмы. Это дает основание предположить, что микроорганизмы играют важную роль в лечебных свойствах нафталанской нефти. Выделенные из лечебной нефти микроорганизмы

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

по аналогии с лечебными грязями можно использовать для восстановления биологической активности отработанной лечебной нефти, а также в целях восполнения ресурсов лечебной нефти путем преобразования в лечебные легких промышленных нефтей более глубоких горизонтов Нафта-ланского месторождения.

REFERENCES

by microorganisms oil destructors of the genera Pseudomonas and Rhodococcus. Cand. chem. Sci. diss.]. Moscow, 2011. 136 p.

ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ / INFORMATION ABOUT THE AUTHORS

Талыблы Аждар Гамбарович, к.б.н., в.н.с., Институт микробиологии НАН Азербайджана.

Адигезалова Вафа Алмановна, к.б.н., доцент кафедры нормальной физиологии, Азербайджанская государственная академия физической культуры и спорта (АзГАФКС).

Ajdar G. Talybly, Cand. Sci. (Biol.), Leading Researcher. Institute of Microbiology National Academy of Sciences of Azerbaijan.

Vafa A. Adigozalova, Cand. Sci. (Biol.), Assoc. Prof. Department of Normal and Sport Physiology. Azerbaijan State Academy of Physical Culture and Sport.