Становление химии тритерпеновых гликозидов женьшеня в ТИБОХ ДВО РАН

Вестник ДВО РАН. 2007. № 6

Н.И.УВАРОВА

Становление химии тритерпеновых гликозидов женьшеня в ТИБОХ ДВО РАН

Я приехала во Владивосток в феврале 1954 г. после окончания аспирантуры в Институте органической химии им. Н.Д.Зелинского. Аспирантуру проходила в лаборатории виниловых эфиров под руководством д.х.н. М.Ф.Шостаковского, темой моей работы был синтез тиовиниловых эфиров.

Химический отдел, в котором мне предстояло работать, располагался в центре города на Ленинской, 50. В основном работа химотдела заключалась в проведении аналитических работ для геологического отдела, который был самым крупным среди научных подразделений ДВФ АН СССР. К органической химии как таковой, а вернее к химии растительных веществ, имели отношение только три сотрудника химотдела, двое из ко -торых, Д.М.Баландин и В.Ф.Черний, занимались лимонником, а третья сотрудница, О.В.Морозова, - анализом древесины.

Здесь необходимо отметить следующее. Заместителем председателя Президиума ДВФ был д.б.н. Борис Павлович Колесников, специалист в области лесоведения, который одновременно работал в Дальневосточном политехническом институте и проявлял интерес к химической переработке древесины, планируя, по-видимому, развитие этого направления в дальнейшем. В 1954 г. приехала по распределению выпускница Уральского лесотехнического института Раиса Петровна Горшкова и была распределена в группу Морозовой.

Химией древесины на Дальнем Востоке занималось немного предприятий: Хорский гидролизный завод (Хабаровский край) и биохимический комбинат в Лесозаводске (Приморье). Какое-то время мы пытались исследовать химический состав скипидаров сухоперегонных и подсочных хвойных пород, однако в дальнейшем работы были прекращены. Тем не менее был установлен контакт с д.х.н. В.А.Пентеговой (Новосибирск, Институт органической химии СО АН СССР), и на базе мастерских этого института были изготовлены ректификационные колонки, позволяющие исследовать скипидары на более высоком уровне.

Примерно в то же врем в филиал была принята выпускница Томского университета Люция Игнатьевна Глебко, имеющая 10-летний опыт работы в различных направлениях аналитической химии, и ей была поручена организация лаборатории микроанализа, которая обеспечила бы в дальнейшем потребности нашего небольшого коллектива.

На Дальзаводе был приобретен баллон ацетилена, и при наличии автоклава емкостью 0,5 л можно было заниматься синтезом виниловых эфиров. Исходными спиртами служили коммерческий ментол, борнеол, любезно предоставленный В.А.Пентеговой, и производные фуранового ряда, полученные нами из фурфурола, а именно фурфуриловый спирт и фурфурилсульфид, которые ранее в синтез с ацетиленом не вовлекались. Полученные виниловые эфиры проявили инсектицидную активность (БПИ, к.б.н. Р.Г. Соболева). С этими веществами и их аналогами можно было работать и дальше, но произошел новый поворот в нашей деятельности.

УВАРОВА Нина Ивановна - доктор химических наук (Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток).

В 1956 г., после возвращения из очередной командировки в Москву, проф. В.Т.Быков пригласил наш коллектив к себе в кабинет и сообщил, что в Москве он имел беседу с выпускником МГУ к.х.н. ст.н.с. Георгием Борисовичем Еляковым, который высказал желание уехать из Москвы, где он работал после окончания химического факультета МГУ, на Дальний Восток и заняться исследованием химии легендарного корня женьшеня. (Следует упомянуть, что в ДВФ СО АН имелся задел по изучению биологической активности препаратов корня женьшеня. Этим направлением руководил к.м.н. И.И.Брехман, работавший в составе отдела химии и физиологии.) Этот вопрос обсуждался со всеми заинтересованными лицами, и, наконец, сошлись на том, что нам следует обратить все свое внимание на женьшень.

Еляков увлек своей идеей переехать на Дальний Восток еще двух выпускников МГУ это были к.х.н. Виктор Евгеньевич Васьковский и Юрий Семенович Оводов, из которых первый был коренным дальневосточником. Следует упомянуть, что как Васьковский, так и Оводов прошли аспирантуру под руководством чл.-корр. АН СССР Николая Константиновича Кочеткова - видного специалиста в области химии природных соединений. Приблизительно в это же время в филиале начали работать выпускницы Ленинградского государственного университета Л.И.Стригина (Кизиветтер) и С.П.Версен и сначала как практикантка, а затем и дипломница кафедры органической химии ДВГУ Элеонора Викторовна Левина (Шапкина). (Попутно замечу, что на базе лаборатории химии природных биологически активных соединений ДВФ СО АН СССР, которой заведовал Г.Б.Еляков, 6 марта 1964 г. постановлением Президиума АН СССР был организован Институт биологически активных веществ ДВФ СО АН СССР, переименованный в 1972 г. в Тихоокеанский институт биоорганической химии.)

К тому времени химический состав корней женьшеня успешно изучался в Японии под руководством проф. Ш.Шибата, и были выяснены интересные данные: за биологическую активность ответственны гликозиды мало тогда известных тритерпеноидов даммаранового

Г.Б.Еляков. Здание Президиума ДВФ. 1960-е годы

Л.И.Глебко. 1962 г. Е.Б.Шенцова, А.М.Толкач, С.ГПолоник, Н.И.Уварова

Н.И.Уварова и А.А.Артюков. Лесозаводск. 1970-е годы Н.И.Уварова со своими первыми дипломниками

Г.И.Прокопенко (справа) и О.Е.Мислицкой (в центре). 1968 г.

ряда. Продуктом кислотного гидролиза гликозидов являлся панаксадиол. Несколько позднее сотрудниками группы Елякова из гидролизата панаксозидов, выделенных из дальневосточного Рашах ginseng, было получено еще одно соединение, которое содержало на одну гидроксильную группу больше панаксадиола и было названо панаксатриолом.

Для исследования таких соединений большое значение имели физико-химические методы: &Н и 13С ЯМР-, ИК-спектроскопия и масс-спектрометрия, рентгеноструктурный метод. У нас на Дальнем Востоке был представлен только метод ИК-спектроскопии. Выпускники физико-математического факультета ДВГУ А.К.Дзизенко и др. проявили большой интерес к этой проблеме. Руководство Института органической химии СО АН СССР (Новосибирск) отнеслось с пониманием к нашим проблемам и разрешило использовать их оборудование для нашей работы в ночное время — такова была нагрузка на спектрометры.

Поскольку немецкие ученые Фишер и Зейлер выделили из эфирного экстракта листьев березы Betula alba вещества, близкие по структуре веществам из корней женьшеня, и назвали их соответственно бетулафолиентриол и бетулафолиентетраол, для выявления природных источников с целью получения полусинтетических аналогов гликозидов женьшеня были изучены различные виды Betula и Alnuc Дальнего Востока и из других регионов России (Н.Д.Похило, Г.В.Малиновская, В.В.Маханьков, С.Г.Полоник, В.Ф.Ануфриев и М.В. Денисенко). При этом было установлено, что в неомыляемой части эфирных экстрактов листьев В. costata, В. mandshurica, В. davurica, В. platyphylla и других содержатся вещества, близкие по структуре бетулафолиентриолу и его аналогам. Видовая идентичность листьев контролировалась заведующим лабораторией хемотаксономии к.б.н. П.Г.Горовым и аспирантом В.И.Барановым. Сбор листьев осуществляли сотрудники лаборатории органического синтеза в первой половине лета.

Спирто-хлороформенный экстракт корней женьшеня фильтровали через сефадекс, при этом были получены две смеси панаксозидов - менее полярная А, В, С и более полярная D, E, F, с которыми далее работали Р.П.Горшкова и др. Методами углеводной химии было показано, что в состав углеводных цепей изучаемых соединений входят остатки глюкозы (панаксозид D), глюкозы и арабинозы (4:1) (панаксозид Е) и глюкозы, арабинозы и ксилозы (панаксозид F). Панаксозиды имеют углеводные цепи линейного строения и при частичном гидролизе образуют один и тот же прогенин. На примере гликозидов женьшеня показана принципиальная возможность наличия в природе нейтральных гликозидов тет-рациклических тритерпеноидов.

Следующим этапом было рассмотрение возможностей известных в ту пору методов гликозилирования. К этому времени некоторые известные гликозиды полициклических спиртов были синтезированы методом Кенигса-Кнорра. (Ортоэфирный метод синтеза

Сотрудники лаборатории органического синтеза ТИБОХ ДВО РАН (слева направо): Н.Ф.Самошина, Л.Н.Атопкина, А.М.Толкач, С.Г.Полоник, В.В.Маханьков, Л.Э.Новикова, О.П.Шестак, Г.В.Малиновская, Н. И.Уварова, Г. П. Матвеева, В.С.Голяхов (начальник ГО ТИБОХ), А. В. Денисенко. 1985 г

гликозидов А.Я.Хорлина и чл.-корр. АН СССР Н.К.Кочеткова стали применять с этой целью сравнительно недавно).

Однако синтетические гликозиды тритерпеноидов и стероидов были малодоступны по причине отсутствия достаточно мягких и стереоспецифически протекающих методов гликозилирования, пригодных для препаративного получения. Поэтому разработка новых методов синтеза гликозидов и подробное выяснение их синтетических возможностей представлялись актуальной задачей.

Хотя число синтезированных гликозидов сложных спиртов к настоящему времени довольно значительно, однако имеющиеся данные не позволяют сделать однозначный выбор метода из-за отсутствия достоверных сведений по балансу расхода введенного в реакцию спирта. Исходным спиртом для модельных синтезов был выбран бетулин, содержащийся в значительных количествах в бересте берез. Бетулин относится к тритерпеноидам лупа-нового ряда, доступен и имеет две гидроксильные группы различной химической природы (первичная спиртовая группа при С-28 и вторичная - при С-3). Интересно было проследить, как происходит гликозилирование этих групп и возможно ли вообще получение синтетических гликозидов с двумя углеводными цепями. Такие гликозиды были получены нами через кристаллический октаацетат ди-О-глюкозида бетулина и тетрадекаацетат ди-О-мальтозида бетулина и идентифицированы с гликозидами по С-3 и С-28 соответственно. Методом ЯМР-спектроскопии показано, что гликозилирование полициклических спиртов протекает строго стереоспецифично и приводит к образованию только р3-глюкозидов и мальтозидов.

Смесь веществ, полученная при конденсации 1 цМ бетулина с 2 цМ метилортоацетата, составляет в сумме 91%. На основе бетулина было синтезировано 6 неизвестных ранее гликозидов и показана возможность синтеза ортоэфирным методом гликозидов, имеющих две углеводные цепи. Вторым спиртом с двумя гидроксилами, вовлеченным в эту реакцию, является панаксадиол. Нами установлено, что причиной возникновения побочных веществ, ацетатов, является образование во время реакции ортоэфиров, изомерных целевым гликозидам. Были введены в синтез панаксадиол, бетулафолиентриол и 3-эпибе-тулафолиентриол (Г.И.Прокопенко). Процесс гликозилирования протекает сложнее в случае панаксадиола, тем не менее удалось выделить и идентифицировать моноацетат диола, диацетат панаксадиола и пентаацетат глюкозида панаксадиола по С-12. Остальные синтетические глюкозиды 3-эпибетулафолиентриола при выделении ведут себя идентично нативным гинзенозидам.

Основным продуктом, выделенным при кислотном гидролизе синтетических панаксо-зидов, был панаксадиол, артефактный продукт изменения нативного агликона. Отмечена большая реакционная способность у вторичного гидроксила по С-3 по сравнению с вторичным гидроксилом при С-12, что связано, по-видимому, с наличием внутримолекулярной водородной связи с кислородом тетрагидрофуранового цикла.

В 1986 г. в ТИБОХ обратилось руководство АО БИОХИММАШ (Москва) с просьбой помочь выяснить причину разницы в биологическом действии настоек, получаемых из корня женьшеня и на основе его клеточной культуры. Это предложение нами было принято, но этому предшествовала большая работа, прежде всего необходимо было располагать набором панаксозидов, содержащихся в нативных корнях женьшеня, получить новые каллусы из тех же растений и изучить их в сравнении. Для этого корни были взяты из популяций корней, выращенных в Анучинском районе Приморского края (с. Староварваровка). Для определения качественного и количественного содержания гинзенозидов использовалась высокоэффективная жидкостная хроматография на микроколоночном хроматографе «Милихром» в сочетании с масс-спектрометрией. Содержание гинзенозидов в суммарной гликозидной фракции (СГФ) было следующее: Яд = 2,70 г, Ше = 2,55 г, Ш = 0,59 г, Ш = 8,10 г, ШЬ2 = 0,98 г, Ше = 1,20 г, Шо = 0,74 г, гШ = 0,19 г, ШЛ = 0,03 г, Ш-Я2 = 0,06 г, что

в сумме составило 17,14 г, т.е. 17,6% от массы СГФ. Все гинзенозиды были охарактеризованы на основе данных ИК- и [Н и 13С ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии, а также физико-химических данных, опубликованных в литературе. Наличие этой коллекции позволило работать далее с клеточной культурой женьшеня.

Вначале было установлено, что промышленные образцы культуры клеток женьшеня практически не содержали гинзенозидов. Далее, используя разработанную нами методику и проанализировав некоторые образцы биомассы, производимой в нашей стране в промышленных масштабах, мы установили, что они содержат в 40-120 раз меньше гинзе-нозидов, чем обычные интактные корни женьшеня, а некоторые промышленные образцы культуры не содержат гинзенозидов вообще. В дальнейшем на основе каллусных культур, полученных из сегментов плантационных корней женьшеня приморской популяции, в лаборатории АО БИОХИММАШ (Н.А.Константинова и др.) путем селекции была создана перспективная клеточная линия ДАН-25, защищенная впоследствии российским патентом. Параллельно с исследованием гликозидного состава клеточных культур женьшеня впервые были проанализированы корни культурного и дикого женьшеня, произрастающего в разных районах Приморского края и других районах Российской Федерации. Также были исследованы на содержание гинзенозидов листья, стебли, бутоны и плоды плантационного женьшеня, выращенные в разных районах культивирования, с целью получения информации о дополнительных источниках гинзенозидов.

В последнее время стали чаще изучать свойства и механизм действия одного из главных метаболитов суммарной гликозидной фракции Ратх ginseng 20-О-р^-глюкопиранозида 20-8-протопанаксадиола (compound К), обладающего широким спектром биологической активности. Последний чаще получают при обработке суммарной гликозидной фракции ферментами, бактериями или кишечной микрофлорой. Нам удалось (Л.Н.Атопкина, В.В.Денисенко) впервые разработать препаративный полусинтетический способ получения этого соединения и двух аналогов. После изучения возможностей ряда синтетических схем авторы остановились на следующей схеме: гликозилирование 12р,208-дигидрокси-даммар-24-ен-3-она р-ацетобромглюкозой с последующим восстановлением натрийбор-гидридом в изопропиловом спирте продуктов реакции, приводящее к образованию смеси двух тетраацетатов 20- и 12-О-р^-глюкопиранозидов 20-8-протопанаксадиола, и после ряда превращений с количественным выходом была получена сумма двух глюкозидов. Так впервые появились синтетические гомологи гинзенозидов. Структура их была доказана результатами исследования методами ИК-, [Н и 13С ЯМР-спектроскопии.

В нашей стране к настоящему моменту накоплен огромный материал в области ресур-соведения и сделан значительный задел по исследованию химии и фармакологии растительных веществ. Целая отрасль по получению ценных веществ может быть создана на основе переработки отходов при заготовке леса и культурных растений.